Tinción de Aceite Rojo O: Una Técnica de Tinción de Lípidos Neutros en Hepatocitos para la Detección de Esteatosis Hepática In Vitro

Resumen

Fuente: Campos-Espinosa, A. et al., Un modelo de esteatosis experimental in vitro: cultivo de células de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, demostramos la tinción in vitro de lípidos neutros en hepatocitos para detectar la esteatosis hepática o la acumulación excesiva de grasa en el hígado. El exceso de grasa se acumula en las células en forma de gotas de lípidos. Oil Red O es un colorante soluble en lípidos que se une a los lípidos neutros intracelulares en estas gotas de lípidos. Cuando se observan bajo un microscopio óptico, estas gotas de lípidos intracelulares aparecen de color rojo intenso.

Protocolo

1. Tinción lipídica con Oil-Red O

1. Coloque un cubreobjetos de cultivo celular en cada pocillo en una placa de 24 pocillos.
2. Siembra 100.000 células de HepG2 por pocillo. Agregue 1 mL de RPMI 1640 estándar.
3. Preincubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
4. Cambie el medio estándar RPMI 1640 por el medio esteatogénico.
5. Incubar durante 24 h, 2 días, 3 días y 4 días, refrescando el medio esteatogénico cada 24 h.
6. Después del tiempo apropiado, deseche el sobrenadante.
7. Lavar con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Deseche el sobrenadante.
8. Fijar con 1 mL de paraformaldehído al 4% en PBS.
9. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
10. Deseche el exceso de paraformaldehído.
11. Enjuague las celdas con 1 mL de agua destilada.
12. Añadir 1 mL de isopropanol al 70% e incubar durante 5 min.
13. Deseche el exceso de isopropanol. No es necesario un lavado de PBS en este punto.
14. Añadir 1 mL de solución de O rojo aceite e incubar durante 30 min.
15. Deseche el exceso de la solución de Oil-red O.
16. Enjuague con 1 mL de agua destilada.
17. Añadir 500 μL de solución de hematoxilina. Incubar durante 3 min.
18. Deseche el exceso de solución de hematoxilina.
19. Enjuague con 1 mL de agua destilada.
20. Observar bajo el microscopio a un aumento de 400x (Objetivo 40x, Ocular 10x).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios de cultivo RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, EE. UU.	31800-022	-
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher-Gibco, EE. UU.	A4766801	-
Línea celular HepG2	ATCC, EE. UU.	HB-8065	Carcinoma hepatocelular, células humanas.
Incubadora humidificada	Corporación Termoelectrónica, EE. UU.	Modelo: 3110	Temperatura (37 °C ± 1 °C), humedad (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Microscopio invertido Eclipse	NIKON, Japón	Modelo: TE2000-S	-
Isopropanol	Sigma-Aldrich, Estados Unidos	I9030-4L	-
Aceite Rojo O Kit	Abcam, Estados Unidos	AB150678	Kit para visualización histológica de grasa neutra.
Paraformaldehido	Sigma-Aldrich, Estados Unidos	P6148-500G	-
Penicilina/estreptomicina	ThermoFisher-Gibco, EE. UU.	Números 15140-122	Antibióticos 10.000 U/mL de penicilina, 10.000 μg/mL de estreptomicina
Solución salina tamponada con fosfato	ThermoFisher-Gibco, EE. UU.	10010-023	-
Pipetas serológicas	Sarstedt, Australia	86.1253.001	No pirogénico, estéril, 5 mL
Pipetas serológicas	Sarstedt, Australia	86.1254.001	No pirogénico, estéril, 10 mL
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich, Estados Unidos	S5761-1KG	Preparación de los medios de cultivo
Oleato de sodio	Biotecnología de Santa Cruz, EE. UU.	SC-215879A	-
Palmitato de sodio	Biotecnología de Santa Cruz, EE. UU.	SC-215881	-
Tripsina 0,05% /EDTA 0,53 mM	Corning, Estados Unidos	25-052-CL	-
Clúster de cultivo celular de 24 pocillos	Corning, Estados Unidos	3524	Fondo plano con tapa. Cultivo de tejidos tratado. No pirogénico, poliestireno, estéril. 1/paquete.