$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Cuantificación fluorométrica de lípidos neutros utilizando rojo de Nilo
NOTA: Solo se necesitan 10 μl de una suspensión de algas a 5 g/L para la lectura de fluorescencia. En general, el aislamiento de la biomasa seca de algas a partir de 1,5 ml de caldo de cultivo es más que suficiente. Además, la intensidad de la luz de la lámpara en el espectrofotómetro puede degradarse con el tiempo. Se recomienda incluir estándares en cada experimento para garantizar que las variaciones en el instrumento no agreguen errores innecesarios a las mediciones.
- Prepare una solución de rojo del Nilo a una concentración de 10 μg/ml disuelta en etanol de grado reactivo de alcohol. Almacene esta solución en la oscuridad a 4 °C.
- Prepare una solución de etanol al 30% (v/v) en agua desionizada y almacene a 4 °C.
- Prepare todas las muestras de algas a la misma concentración de biomasa (se recomiendan 5 g/L) y de la misma manera que los patrones utilizados en la medición. Para ello, suspenda las muestras presecas en la cantidad adecuada de tampón de fosfato (0,6 g/L de fosfato de potasio dibásico, 1,4 g/L de fosfato de potasio monobásico) o ajuste la concentración de un cultivo de algas en crecimiento a 5 g/L con tampón de fosfato después de medir la turbidez><.
NOTA: Las mediciones realizadas en cultivos de algas vivas a menudo tendrán un error mayor asociado dependiendo de la precisión de la curva de calibración de turbidez. La resuspensión de muestras secas puede requerir el uso de un homogeneizador para dispersar completamente la biomasa.
- Para cada muestra, mezcle 80 μl de la solución de etanol al 30%, 10 μl de la solución de rojo del Nilo y 10 μl de suspensión de algas en un solo pocillo de una placa de 96 pocillos. Para tener en cuenta adecuadamente la variabilidad de la medición de fluorescencia, realice 5 réplicas de cada muestra.
- Ejecute una curva de calibración de dos puntos con estándares para tener en cuenta las variaciones diarias en el instrumento y la preparación. Prepare los patrones para la medición de fluorescencia utilizando el mismo procedimiento que las muestras.
NOTA: Generalmente, dos puntos son suficientes para la recalibración del instrumento, se pueden ejecutar tres puntos para verificar la linealidad.
- Realice las mediciones de fluorescencia en un espectrofotómetro lector de placas de pocillos múltiples. Se encontró que las siguientes condiciones produjeron los resultados más consistentes:
- Agitar a 1.200 rpm, orbitar 3 mm, durante 30 segundos.
- Incubar a 40 °C durante 10 min.
- Agitar a 1.200 rpm, orbitar 3 mm, durante 30 segundos.
- Récord de fluorescencia, excitación a 530 nm, emisión a 604 nm.
- Convierta las mediciones de fluorescencia en contenido de aceite utilizando los resultados de los estándares internos.