Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de reactivos
- Aislamiento y calcificación de CMVM de aorta murina
- Solución para la digestión aórtica:
- Prepare una solución fresca (~3-5 ml por aorta recolectada) con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene 175 U/ml de colagenasa tipo 2 y 1,25 U/ml de elastasa. Esterilice la solución con un sistema de filtración al vacío de 0,22 μm y mantenga la solución en hielo hasta su uso.
- Medios celulares:
- Complemente 500 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con un 10% de suero fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Caliente el medio a 37 °C antes de usarlo.
- Medios de calcificación:
- Medio de calcificación A (NaPhos; utilizado en líneas celulares de ratón):
- Complemente 100-500 ml de DMEM (volumen según sea necesario) con 10% de suero fetal bovino, 2 mM de fosfato sódico, 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Calentar el medio a 37 °C antes de usarlo.
O
- Medio de calcificación B (βGP/Asc/DEX; utilizado en líneas celulares de ratón o humanas):
- Complemente 100-500 ml de DMEM (volumen según sea necesario) con 10% de suero fetal bovino, 10 mM de β-glicerofosfato disódico, 50 μg/ml de ácido L-ascórbico, 10 nM de dexametasona, 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Caliente el medio a 37 °C antes de usarlo.
>2. Disección del ratón
- Eutanasia de ratón con una inyección intraperitoneal de pentobarbital de 200 mg/kg.
- Coloque al animal en decúbito supino sobre la tabla de disección y estabilícelo pegando cada pata a la tabla. Con un microscopio de disección y unas tijeras pequeñas, haga una incisión en la línea media que se extienda desde la parte inferior del abdomen hasta la parte superior del tórax.
- Retire la piel con pinzas y retire el peritoneo, revelando los órganos abdominales. Extirpar los órganos gastrointestinales, teniendo cuidado de no seccionar la aorta.
- Haga una incisión lateral en el diafragma anterior y continúe la incisión a través del abdomen. Con unas tijeras de disección, libere la caja torácica cortando los lados de las costillas y quitando el tejido blando adherido a la parte superior del esternón. Retira la caja torácica, dejando al descubierto los pulmones.
- Deje el corazón en su lugar inicialmente (para ayudar a identificar y diseccionar la aorta proximal) y extraiga cuidadosamente los pulmones. Extirpe el timo, la tráquea y el esófago con cuidado, asegurándose de que la aorta permanezca intacta.
- Con pinzas finas rectas y tijeras de microdisección, extraiga el tejido blando que rodea la aorta desde la bifurcación ilíaca hasta el arco aórtico, prestando especial atención a la extracción de la grasa periaórtica (Figura 1A). Extraer el resto de grasa y tejido blando que rodea las ramas grandes del arco aórtico (es decir, las arterias braquiocefálica, carótida común y subclavia, Figura 1B)
nota: Es importante eliminar la grasa de la aorta porque la grasa puede aumentar la señal de fondo al realizar imágenes de fluorescencia.
- Extraer el corazón de la cavidad torácica, separarlo cuidadosamente de la aorta proximal, y desecharlo. Transecto de la aorta distal en la bifurcación ilíaca. Con una aguja de insulina, inyecte solución salina normal en la aorta desde el arco aórtico para lavar las células sanguíneas restantes. Separe la aorta junto con los vasos del arco aórtico, eliminándola completamente del cuerpo.
- Coloque la aorta en una solución salina normal sobre hielo hasta que esté lista para la toma de imágenes.
>3. Aislamiento de células primarias del músculo liso vascular aórtico murino
- Coloque las aortas en HBSS frío hasta que se completen las disecciones. Corta con cuidado cualquier resto de grasa periaórtica y tejido blando, dejando solo la aorta.
- Bajo una campana estéril de cultivo de tejidos, transfiera las aortas a la solución de digestión aórtica en placas de cultivo de tejidos de 35 mm x 10 mm. Colocar en una incubadora a 37 °C durante 30 min con un suave balanceo intermitente. Después de la digestión, las aortas exhiben una apariencia estirada o deshilachada.
- Con el microscopio de disección y las pinzas estériles, retire la capa adventicial externa de la aorta manteniendo intacta la capa medial. Una técnica para eliminar la adventicia es despegar la capa externa de la aorta en un extremo y eliminarla de la capa medial subyacente como si un calcetín se pudiera pelar y quitar.
- Una vez que se haya retirado la capa adventicia, coloque la aorta restante en una nueva placa de cultivo de tejidos con medios de cultivo celular y almacene a 37 °C con 5% de CO2 durante 2-4 horas.
- Bajo una capucha estéril y utilizando unas tijeras de microdisección estériles de 3 mm, corte la aorta en anillos de 1-2 mm de ancho.
- Coloque estos anillos en una nueva placa de cultivo de tejidos con solución de digestión aórtica e incube a 37 °C con un suave balanceo intermitente durante 120 min. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces durante esta incubación para resuspender las células.
- Añadir 5 ml de medios de cultivo celular tibios a la solución de digestión y transferir a un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar el tubo durante 5 min a 200 x g.
- Aspire el medio y vuelva a suspender las células en el volumen deseado de medio de cultivo celular (por ejemplo, 5 ml).
- Colocar la cantidad total de células aisladas de cada aorta en un matraz de cultivo celular de 25cm2 e incubar a 37 °C con 5% de CO2. Propagar células utilizando técnicas estándar, como se ha descrito anteriormente. Durante los primeros 7-10 días de incubación, cambie el medio cada 72-96 horas. A medida que las células se acerquen a la confluencia, reponga los medios con más frecuencia (cada 48 horas).
nota: Puede llevar muchas semanas desarrollar una cantidad suficiente de células.
- Una vez confluentes, las células pasan con tripsina que se calienta a 37 °C.
- Añada 0,5-1,0 ml de tripsina a cada matraz de cultivo e incube durante 3-5 min; golpee suavemente el costado del matraz cada 30-60 segundos según sea necesario para separar las células de la superficie.
- Una vez que las células se desprendan del fondo del matraz, añada 10 ml de medio celular a las células en tripsina. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Aspire el medio y la tripsina del pellet de la célula. Vuelva a suspender las células en la cantidad deseada de medios celulares frescos (por ejemplo, 5-10 ml) y transfiéralas a un nuevo matraz (con algunas células transferidas a un portaobjetos de cámara).
- Al primer paso de las células, confirme el linaje de células del músculo liso con técnicas de inmunocitoquímica estándar, como se describió anteriormente, utilizando un anticuerpo dirigido contra la actina del músculo liso α.
>4. Inducir la calcificación de células de músculo liso cultivadas
- Celdas de placa obtenidas a partir de 3.12 en un formato de 6 pocillos.
nota: Se recomienda comenzar con 1 x 105 células/pocillo en un volumen total de 2,0 ml de medio celular por pocillo.
- Permita que las células crezcan en el medio de calcificación A o B durante al menos 7 días en un formato de placa de 6 pocillos. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2.
- Cambie el medio celular cada 48 horas.
>5. Evaluación de la calcificación de VSMC utilizando el método de tinción de von Kossa
NOTA: El método de von Kossa para medir la calcificación de la matriz extracelular de tejidos o células cultivadas se basa en la sustitución de iones de calcio unidos a fosfato por iones de plata. En presencia de luz y compuestos orgánicos, los iones de plata se reducen y se visualizan como plata metálica. La plata no reaccionada se elimina mediante un tratamiento con tiosulfato de sodio. El protocolo para la tinción de von Kossa es el siguiente:
- Aspire medios de placas de cultivo celular.
- Fije las células colocándolas en 1 ml de formalina al 10% a temperatura ambiente durante 20 min.
- Retire la formalina y lave las celdas fijas con agua destilada durante 5 min.
- Incubar las células en 1 ml de solución de nitrato de plata al 5% bajo una bombilla de 60-100 W durante 1-2 horas.
- Aspire la solución de nitrato de plata y lave con agua destilada durante 5 min.
- Retire la plata sin reaccionar colocando las células en 1 ml de solución de tiosulfato de sodio (p/v) al 5% en agua destilada durante 5 min.
- Enjuague las células con agua destilada durante 5 min. Repita los lavados 3 veces. La tinción de von Kossa está lista para la obtención de imágenes con microscopía de luz invertida estándar.
- Paso opcional: Contratinción con 1 ml de rojo nuclear rápido durante 5 min. A continuación, realice tres lavados con agua destilada (5 min cada uno).
