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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Protocolo de tinción de eosina
- Para fijar muestras de tejidos blandos, llene un tubo de centrífuga de 50 ml con una solución fijadora que contenga 9,5 ml de solución de formaldehído (FA) al 4% (v/v) y 0,5 ml de ácido acético glacial (AA).
nota: Prepare la solución de FA recién hecha a partir de una solución de FA libre de ácido al 37% estabilizada con aproximadamente un 10% de metanol. Diluya aún más la solución de FA con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Elija DPBS sin calcio ni magnesio. Conserve la solución diluida de FA no más de un mes. Durante la acidificación, el pH de la solución fijadora cambia de neutro a aproximadamente 3,
cautela: Debido a que la AF es tóxica para los órganos agudos, corrosiva y cancerígena, el uso de una campana extractora es obligatorio y se debe usar el equipo personal de protección adecuado.
- Agregue la muestra de tejido blando recién extraída a un tubo de centrífuga de 50 mL y refrigere el tubo de centrífuga de 50 mL durante 24-72 h.
nota: El protocolo se puede pausar aquí.
- Lave la muestra de tejido blando con solución de DPBS durante 1 hora.
- Para teñir la muestra de tejido blando fijada (por ejemplo, un riñón de ratón entero), coloque el tejido blando en 2 ml de solución de tinción de eosina Y e incube la muestra durante 24 h. Mantenga la muestra en una placa de agitación horizontal para un balanceo suave (aprox. 60 rpm) durante el proceso >nota: La solución de tinción de eosina Y tiene una concentración del 30% (p/v) en agua destilada. Elija el volumen de la solución de tinción de tal manera que la muestra quede completamente cubierta por la solución de tinción y permita que la muestra se mueva libremente dentro del recipiente de muestra. El tiempo de incubación puede diferir para otras muestras y debe ajustarse en consecuencia.
- Después de la tinción, retire la muestra de tejido blando con cuidado del recipiente de muestras.
- Retire con cuidado el exceso de agente manchante con papel de seda de celulosa.
- Coloque la muestra de tejido blando en un recipiente de muestra cónico sobre una fase de vapor de etanol para su almacenamiento y uso posterior.
nota: El recipiente cónico de la muestra siempre debe contener unas gotas de etanol al 70% (v/v) en el fondo del tubo para mantener la muestra de tejido blando húmeda y evitar artefactos.