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1. Preparación de soluciones de tinción
- Filtre la solución madre de hematoxilina Harris para eliminar los sólidos que se hayan precipitado.
- Dobla un filtro de café por la mitad para que el filtro cree un cono. Abra el panel lateral para que el líquido pase a través del filtro, permitiendo que se atrapen los residuos.
- Coloque el filtro dentro de un embudo y el embudo en una botella de vidrio para medios. Vierta gradualmente el caldo de hematoxilina a través del filtro.
cautela: La hematoxilina es peligrosa en caso de contacto con los ojos, ingestión e inhalación. Siempre use una bata de laboratorio y guantes y manipule la solución madre en una capucha química.
- Prepare HCl al 0,05% añadiendo 125 μL de HCl 12 N a 250 mL de ddH2O.
- Prepare la mezcla de solución de eosina Y-floxina B combinando 25 mL de eosina Y (aq) al 1%, 2,5 mL de floxina B (aq) al 1%, 195 mL de etanol al 95% y 1 mL de ácido acético glacial en una botella de vidrio. Mezcle bien removiendo y almacene a RT
cautela: La eosina Y es peligrosa en caso de contacto con los ojos, ingestión e inhalación. Siempre use una bata de laboratorio y guantes y manipule la solución madre en una capucha química.
- Prepare etanol al 2% agregando 2 mL de alcohol etílico puro a 98 mL de agua de huevo.
cautela: El alcohol etílico es un irritante para los ojos. Siempre use el equipo de protección adecuado cuando manipule alcohol etílico. También es inflamable y debe manipularse y almacenarse en consecuencia.
NOTA: Prepare etanol fresco al 2% cada vez antes de realizar el tratamiento agudo con etanol.
>2. Tinción de hematoxilina y eosina de secciones de parafina
- Desparafina los portaobjetos sumergiéndolos en xileno al 100% durante 15 minutos; cámbielo a xileno al 100% fresco durante otros 15 minutos.
- Rehidrate los portaobjetos sumergiéndolos en la siguiente serie de etanol graduado hasta que el líquido salga limpiamente de los portaobjetos. Para cada solución, sumerja 8-10 veces, 2 s por inmersión: 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol, 30% etanol y agua desionizada.
nota: El protocolo se puede detener aquí, y los toboganes se pueden dejar en RT en el agua durante varias horas. Si es necesario, los portaobjetos se pueden almacenar a 4 °C en agua O/N.
- Coloque los portaobjetos en hematoxilina Harris 100% filtrada durante 4 min. Transfiéralos inmediatamente al recipiente con agua desionizada. Deje correr agua desionizada en la esquina trasera del recipiente más alejada de las secciones. Vacíe el recipiente periódicamente hasta que el agua deje de estar morada.
nota: No dejes que el agua corra directamente sobre los toboganes, ya que las secciones pueden desprenderse de los toboganes.
- Verifique rápidamente la intensidad de la hematoxilina en un microscopio de disección usando luces de cuello de cisne; no permita que los portaobjetos se sequen. Si la mancha ha alcanzado la intensidad deseada, continúe con el siguiente paso. Si el color no es lo suficientemente oscuro, coloque los portaobjetos en hematoxilina al 100% durante 1 minuto y repita los lavados con agua antes de volver a revisar.
nota: La hematoxilina debe ser lo suficientemente oscura para que el color no se pierda durante la tinción con eosina. Sin embargo, si se observa tinción de hematoxilina en el citoplasma, las secciones se tiñen en exceso.
- Sumerja los portaobjetos dos veces en HCl al 0,05% y transfiéralos inmediatamente al recipiente con agua desionizada limpia. Vacíe el agua y vuelva a llenar el recipiente con agua dos veces.
- Transfiera los portaobjetos a etanol al 95% durante 30 s y luego transfiéralos a un nuevo recipiente con etanol al 95% durante 30 s.
- Coloque los portaobjetos en la solución de eosina Y-floxina B durante 2 min. Transfiera los portaobjetos al recipiente anterior de etanol al 95% y compruebe rápidamente la intensidad del color bajo el microscopio de disección. Si la tinción es suficiente, continúe con el siguiente paso. De lo contrario, vuelva a la solución de eosina durante 30 s, vuelva a comprobar y repita según sea necesario.
nota: La tinción suficiente de eosina es de color rosa brillante y aparece en claro contraste con la tinción de hematoxilina. Asegúrese de limpiar cualquier solución de la parte posterior de los portaobjetos cuando los revise bajo el microscopio para que no se observe ningún color falso. Debido a que la eosina se compone de etanol al 95%, los períodos prolongados de tiempo en etanol al 95% mientras se verifica la intensidad del color pueden filtrar parte del color.
- Transfiera los portaobjetos a isopropanol al 100% durante 15 s. Reemplácelos con isopropanol al 100% fresco y vuelva a colocar los portaobjetos en el isopropanol durante otros 15 s. Repita este proceso para un total de 6 lavados con isopropanol.
cautela: El isopropanol es un irritante ocular y respiratorio. Asegúrese siempre de usar el equipo de protección adecuado y evite salpicaduras. También es altamente inflamable y debe almacenarse y manipularse en consecuencia.
nota: Para ahorrar en reactivos, deseche solo el primer lavado de isopropanol (el más rosado). Mantenga las otras cinco soluciones de lavado en botellas numeradas del 1 al 5, para reutilizarlas en la próxima mancha. Al reutilizar lavados, comience con el frasco numerado "1" y deséchelo después de usarlo. Una vez que se haya utilizado el lavado "2", viértalo en la botella "1", y así sucesivamente. El lavado final siempre debe ser de isopropanol fresco.
- Coloque los portaobjetos en xilenos al 100% durante 3 min. Retire un portaobjetos a la vez y coloque un cubreobjetos.
- Agregue suficiente medio de montaje para cubrir las secciones y sumérjalas en xileno 100%.
nota: Este paso alisará la superficie del medio de montaje y eliminará las burbujas.
- Aplique un cubreobjetos en la parte inferior del portaobjetos.
nota: El medio de montaje debe tirar de la corredera hasta su posición. Si el cubreobjetos no está recto o completamente asentado, golpéelo suavemente en su lugar.
- Seque cualquier exceso de medio de montaje en una toalla de papel hasta que solo se vea una línea delgada. Sumerge una toallita de papel en el xileno y limpia la parte posterior del portaobjetos para eliminar cualquier medio que haya goteado. Coloque el portaobjetos plano sobre una superficie resistente pero móvil, como un trozo de cartón. Cubra todas las diapositivas restantes de la misma manera. Deje que el xileno se evapore en la campana durante 10 min.
nota: Cualquier material contaminado con xileno debe retirarse y desecharse en un recipiente sellado en la campana para evitar que se escapen los vapores.
- Deje que el medio de montaje se endurezca en RT O/N.
>3. Obtención de imágenes y almacenamiento de portaobjetos teñidos
- Secciones de imagen en un microscopio invertido compuesto.
nota: Los portaobjetos se pueden mantener a temperatura ambiente indefinidamente.