Tinción con azul de metileno para evaluar la formación de colonias metastásicas in vitro: un procedimiento de tinción para evaluar la metástasis mediante la cuantificación de células cancerosas recolectadas a partir de un modelo de ratón canceroso

Resumen

Fuente: Nagai-Singer, M. A., et al. Uso del análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, describimos el procedimiento de tinción con azul de metileno para cuantificar la carga metastásica mediante el recuento de colonias teñidas obtenidas mediante el cultivo de células cancerosas recolectadas de órganos distantes de un modelo de ratón después de la inyección.

Protocolo

Todos los procedimientos de modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Procesamiento de tejidos

NOTA: Todos los pasos de esta sección deben realizarse utilizando una técnica estéril.

1. Etiquete 1 tubo cónico de 15 mL por ratón y agregue 2,5 mL de mezcla de colagenasa tipo IV y 30 unidades de elastasa a cada tubo. Para hacer una mezcla de colagenasa tipo IV, disuelva 2 mg de colagenasa tipo IV por ml, 1x HBSS y filtro estéril. Puede almacenarse hasta 12 meses a -20 °C y descongelarse cuando sea necesario.
2. Transfiera el pulmón de ratón recolectado al segundo pocillo limpio de HBSS 1x para esa muestra. Revuelva con fórceps para extraer la sangre restante. Transfiera el pulmón limpio a la placa de cultivo de tejidos vacía de 3,5 cm. Pica el pulmón con unas tijeras. Enjuague la placa con 2,5 mL de 1x HBSS, transfiera 1x HBSS y trozos de pulmón a un tubo cónico de 15 mL que ya contenga cóctel de colagenasa/elastasa (5 mL en total).
3. Incubar durante 75 minutos a 4 °C. Continúe mezclando muestras durante este tiempo, así que coloque los tubos en un balancín o rueda giratoria. Durante esta etapa de incubación, etiquete tubos de centrífuga de 50 ml y placas de cultivo de tejidos de 10 cm para cada ratón. Si va a realizar una dilución, etiquete suficientes placas de cultivo de tejidos de 10 cm para las diluciones.
   nota: Etiquete la tapa de las placas de cultivo de tejidos. Si se etiqueta la placa en sí, la escritura interferirá con el análisis de Fiji-ImageJ.
4. Lleve el volumen de cada tubo hasta 10 mL en total con 1x HBSS. Vierta el contenido sobre un colador de células de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml para cada muestra. Use el émbolo de una jeringa de 1 ml para moler suavemente la muestra a través del colador para permitir que se filtren más células.
5. Centrifugar durante 5 minutos a 350 x g a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 10 mL de 1x HBSS. Repita este paso dos veces.
6. Resuspenda el pellet en 10 mL de 60 μM de medio de cultivo completo 6TG, ya sea RPMI o IMDM. Muestre las muestras en placas de cultivo celular de 10 cm, utilizando un esquema de dilución si lo desea. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 5 días.
   NOTA: 1:2, 1:10 y 1:100 son diluciones comunes que deberán determinarse empíricamente en función de los parámetros del estudio.
   PRECAUCIÓN: El 6TG es tóxico. Tenga cuidado al manipular y siga todas las pautas de salud y seguridad ambiental para la eliminación.

>2. Placas de tinción

1. Vierta los medios de cultivo de las placas en el contenedor de residuos adecuado. Fije las células agregando 5 mL de metanol sin diluir por placa e incube durante 5 minutos a RT, asegurándose de agitar el metanol para que cubra toda la placa><. cautela: El metanol es peligroso si se ingiere, inhala o está en contacto con la piel. Use una campana extractora para este paso.
2. Vierta el metanol de las placas en el contenedor de residuos adecuado. Enjuague las placas con 5 ml de agua destilada por placa y vierta el agua en el contenedor de residuos adecuado. Agregue 5 mL de azul de metileno al 0,03% por placa e incube durante 5 minutos en RT, asegurándose de agitar la solución de azul de metileno para que cubra toda la placa.
3. Vierta el azul de metileno en el contenedor de residuos adecuado. Enjuague las placas nuevamente con 5 mL de agua destilada por placa. Voltee los platos boca abajo y séquelos contra una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Coloque la placa en su tapa y deje secar al aire durante la noche a RT.
   nota: Las colonias metastásicas serán azules. Una vez que las placas se secan, se pueden almacenar en RT indefinidamente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
metanol	Fisher Científico	A412SK-4
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	03978-250ML
RMPI-1640 Medio	ATCC	30-2001
Balancín o rueda giratoria	cualquier	cualquier
Filtro desechable estéril con membrana PES	ThermoFisher Scientific	568-0010
Colagenasa tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138
Placas de cultivo de tejidos de 3,5 cm	Nunclon	153066
Placas de cultivo de tejidos de 10 cm	Fisher Científico	08-772-22
Tubo de centrífuga de 15 mL	Fisher Científico	14-959-70C
1X Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	Termo Científico	SH3026802
Tubo de centrífuga de 50 mL	Fisher Científico	14-959-49A
Filtro de células de 70 μM	Fisher Científico	22-363-548
70% etanol	Sigma Aldrich	E7023	Diluir al 70% con agua desionizada
incubadora			Debe ser capaz de 5% de CO2 y 37 °C
fórceps	Roboz	RS-8100
centrífuga	cualquier	cualquier	Debe ser capaz de 125 x g y 300 x g
agua destilada	cualquier	cualquier
elastasa	MP Biomedicals	100617