Tinción de células con ácido peryódico-Schiff: una técnica in vitro para detectar los niveles de glucógeno en células mononucleares de sangre periférica

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Aislamiento de PBMC de sangre entera

>NOTA: Realice este procedimiento en una cabina de bioseguridad utilizando técnica estéril y equipo esterilizado por el fabricante.

1. Vierta con cuidado 10-15 ml de sangre entera de los tubos de extracción de sangre heparinizada (anticoagulante) en un tubo cónico estéril de 50 ml. En el caso de derrames de sangre leves, limpie con ddH₂O y 70% de EtOH con un pañuelo de limpieza.
2. Diluya la sangre en el tubo cónico en una proporción de 1:1 con solución salina tampón de fosfato (PBS 1x) pH 7.4. Asegúrese de que el volumen total máximo no supere los 30 ml.
3. Mezclar suavemente con una pistola de pipetas serológicas evitando burbujas.
   nota: NO mezcle invirtiendo el tubo para evitar la acumulación de sangre en el tapón y la posterior filtración durante la centrifugación.
4. Añadir 13 ml de Ficoll-paque (ver tabla de materiales), a un nuevo tubo cónico de 50 ml de capacidad. Mantenga el tubo en posición vertical en la rejilla.
5. Con una pipeta de transferencia, tome sangre diluida y toque la punta de la pipeta de transferencia con la pared interior del tubo cerca de la parte superior. Con una presión lenta y constante, transfiera la sangre a lo largo de la pared interior del tubo formando una capa de sangre encima de la capa de sacarosa. Realice este paso varias veces hasta que se haya transferido toda la sangre.
6. Tape herméticamente el tubo y centrifugue el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos a 700 x g en un rotor oscilante con aceleración media ajustada a 5 y deceleración a CERO.
7. Saque lentamente el tubo y, sin alterar las capas, llévelo de regreso al gabinete de bioseguridad.
8. Recoja cuidadosamente la capa leucocitaria (capa fina de color blanco turbio), donde se encuentran las PBMC, colocada entre las capas de PBS/plasma y ficoll con una pipeta de transferencia. Evite acumular la capa de sacarosa y no altere la capa de glóbulos rojos.
9. Transfiera el pelaje leucocitario a un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml. Es posible que sea necesario repetir varias veces el paso 1.8 para recopilar todas las PBMC.
10. Agregue PBS pH 7.4 al tubo con el PBMC y llene hasta la marca de 45 ml. Agite bien el tubo. No haga vórtice.
11. Lavado 1: Centrifugar durante 15 minutos a 480 x g con la aceleración y deceleración máximas ajustadas a 9. Observe la formación de una bolita de PBMC en el fondo del tubo cónico.
12. Deseche el PBS (sobrenadante) en un vaso de precipitados de plástico con 10 ml de lejía.
13. Afloje el pellet de celda "trasiendo" suavemente contra una superficie ondulada (es decir, rejilla vacía). No haga vórtice.
14. Añadir 25 ml de PBS fresco pH 7,4 al tubo. Si se está procesando más de un tubo, agrupe los gránulos en este paso.
15. Lavado 2: Centrifugar el tubo durante 12 minutos a 480 x g con la aceleración y desaceleración máximas ajustadas a 9.
16. Deseche el PBS (sobrenadante) en el vaso de precipitados de plástico con un chorrito de lejía.
17. "Rejilla" suavemente contra una superficie ondulada (es decir, una rejilla vacía). No haga vórtice.
18. Agregue 25 ml de PBS fresco al tubo.
    1. Extraiga 50 μl de las células y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga para el recuento de viabilidad.
    2. Agregue una cantidad igual (50 μl) de azul de tripán (una mancha de viabilidad) y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar suavemente.
19. Extraiga 10 μl y transfiéralo a un hemocitómetro para comprobar la viabilidad de las células por ml. Registre el número de células/ml.
20. Extraiga la cantidad deseada de celdas y centrifugue el tubo durante 12 minutos a 480 x g con la aceleración y deceleración máximas ajustadas a 9.
21. Deseche el PBS (sobrenadante) en el vaso de precipitados con lejía.
22. "Rejilla" suavemente contra una superficie ondulada (es decir, una rejilla vacía). Agregue 80 μl de PBS en el tubo.

>2. Haciendo que el PBMC se deslice

1. Coloque 80 μl de las células en un portaobjetos de microscopio. Unta la gota con la ayuda de otro portaobjetos o coloca 2 gotas de 40 μl cada una en ambos extremos del portaobjetos.
2. Deje secar la corredera en la cabina de seguridad biológica. Etiqueta el portaobjetos con un lápiz en el lado esmerilado.

>3. Fijación de las muestras en los portaobjetos

1. Prepare la solución fijadora mezclando 0,5 ml de formaldehído al 37% con 4,5 ml de etanol al 99%.
2. Después de que los portaobjetos se sequen, saque 2 ml de la solución fijadora recién hecha y viértala en el portaobjetos para cubrir toda la superficie del portaobjetos.
3. Deje la solución en el portaobjetos durante 1 minuto. Enjuague el portaobjetos durante 1 minuto con agua del grifo y déjelo secar al aire.

>4. Fabricación de la solución de amilasa para el control de negativos

1. Tomar 0,25 g de amilasa en polvo y disolver en 50 ml de agua destilada. Vierta la solución en un vaso limpio de 100 ml.
2. Sumerja el portaobjetos en el vaso de precipitados de modo que la mitad del portaobjetos reciba el tratamiento y la otra mitad permanezca sin tratar y, a continuación, incube durante 15 minutos a temperatura ambiente (Figura 1C).
3. Anote en qué lado del portaobjetos se recibe el tratamiento con amilasa. Dibuje una línea en la parte posterior del portaobjetos que indique el límite entre el tratamiento y el control.
4. Lave los portaobjetos con ddH₂O para eliminar la solución de amilasa y deje que el portaobjetos se seque al aire.

>5. Realizar tinción e imágenes de Schiff de ácido peryódico (PAS)

NOTA: Los reactivos de PAS son tóxicos por inhalación y son corrosivos, por lo que los pasos deben realizarse en una campana de gases químicos, y los productos de desecho deben eliminarse adecuadamente de acuerdo con las pautas institucionales.

1. Coloque el portaobjetos sobre una superficie plana y vierta 1,50-2,00 ml de solución de ácido peryódico sobre la muestra. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
2. Enjuague los portaobjetos con varias cargas de agua destilada.
3. Vierta 1,50-2,00 ml del reactivo de Schiff en el portaobjetos e incube a temperatura ambiente durante 15 min.
4. Lave el portaobjetos con agua destilada durante 5 minutos y déjelo secar al aire.
5. Aplique 10 μl de soporte de montaje en el portaobjetos y cúbralo con dos cubreobjetos pequeños, o aplique 50 μl y use un cubreobjetos grande.
6. Aplica esmalte de uñas transparente en los bordes del cubreobjetos, déjalo secar toda la noche.

>6. Obtener imágenes con el microscopio óptico binocular utilizando el objetivo 100X

Figura 1: Metodología paso a paso de la tinción de PAS en PBMC.(A) Primero, el aislamiento de PBMC se logra a través del gradiente ficoll, el panel izquierdo muestra la preparación antes de la centrifugación, el panel derecho lo muestra después de la centrifugación donde se observa la capa leucocitaria que contiene el PBMC en el centro del tubo. (B) Los PBMC aislados se fijan al portaobjetos utilizando una solución fijadora de formalina-etanol. El portaobjetos se enjuaga suavemente con agua destilada de una botella de lavado de plástico. (C) A continuación, el portaobjetos se coloca en un vaso de precipitados de 100 ml lleno hasta la mitad con una solución de amilasa, que disolverá el glucógeno. El portaobjetos se enjuaga suavemente. (D) El portaobjetos se trata con una solución de ácido peryódico, donde se produce la oxidación de los sacáridos. Los portaobjetos se enjuagan suavemente; Esto eliminará el exceso de ácido peryódico y detendrá el paso de oxidación. (E) Cuando se agrega el reactivo Schiff a los portaobjetos, reaccionará con los aldehídos creados durante el paso de oxidación. Este reactivo incoloro dará como resultado un producto de color magenta rojo intenso. Los portaobjetos se enjuagan suavemente para eliminar el exceso de reactivo Schiff.