Tinción de violeta cristalino: una técnica para visualizar células cancerosas resistentes a los medicamentos mediante ensayos de formación de colonias

En este artículo

Resumen

Fuente: Mohr, L. et al., Generación de modelos de células de cáncer de próstata de resistencia al agente antimitótico docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

En este video, demostramos un ensayo de viabilidad celular utilizando un procedimiento de tinción de cristal violeta para células cancerosas resistentes a medicamentos quimioterapéuticos.

Protocolo

>1. Caracterización funcional de la resistencia adquirida a docetaxel mediante el ensayo de formación de colonias

NOTA: En este protocolo, la quimiorresistencia se ha evaluado utilizando ensayos de formación de colonias. Los métodos alternativos utilizados para evaluar la viabilidad celular (es decir, los ensayos MTS) se pueden utilizar en función de las preferencias de los investigadores.

Coloque 2.000 células (DU145 o 22Rv1, tanto parentales como resistentes al docetaxel) por pocillo en placas de 6 pocillos, utilizando 2 mL de medio por pocillo.
A las 24 h, añadir concentraciones crecientes de Docetaxel (células parentales: 0,25, 0,5, 1, 2,5 y 5 nM; Celdas DR: 50, 125, 250, 500 y 1.000 nM) para las líneas celulares DU145 y 22Rv1. Agregue DMSO solo a un pocillo como control al mismo volumen que se usa para la dosis más alta de Docetaxel.
Después de 72 h, aspire los medios que contengan el fármaco y agregue los medios frescos sin Docetaxel.
Incubar las placas durante 1-2 semanas hasta que las colonias sean visibles bajo el microscopio.
Para teñir las colonias, lávelas suavemente con 2-3 mL de PBS e incube con 2-3 mL de solución de violeta cristalina (0,1% p/v en formalina al 10%) durante 20 min dentro de la campana de cultivo de tejidos o una campana de gases.
Retire la solución de tinción y lave las placas con 2-3 mL de_H2O, retire las placas de_H2O y séquelas al aire.
Analice el resultado visualizando los pozos y contando manualmente las colonias con la ayuda de un rotulador (para evitar contar las mismas colonias dos veces) y represente el porcentaje de viabilidad celular en un gráfico. Tome imágenes digitales de las placas para la representación de la figura (Figura 1).

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Resultados

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Figura 1: Caracterización funcional y fenotípica de los modelos celulares resistentes a Docetaxel. Ensayos representativos de formación de colonias de células parentales y resistentes a Docetaxel tratadas con las concentraciones indicadas de Docetaxel durante 72 h. El porcentaje de colonias por cada concentración de tratamiento se representa en el gráfico incluido. Los experimentos son triplicados y los datos representan la media ± ...