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1. Preparación del gel
- Realice SDS-PAGE con geles de proteína Bis-Tris al 4% - 12% (1 mm, 15 pocillos) utilizando un mini tanque de gel lleno de tampón de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES).
- Diluya las muestras con una mezcla de agua destilada, tampón de dodecil sulfato de litio (LDS) y un agente reductor de muestras.
- Cargue el primer carril con el doble de la cantidad de material (10 μL), seguido de la cantidad de material normal (5 μL) y una serie de diluciones dobles del material a partir de entonces (13 diluciones, de 2x a 8192x).
- Haga funcionar el gel a un voltaje constante de 200 V durante 30 minutos.
2. Fijación del gel
- Después de la electroforesis, sumerja los geles en una solución de 100 ml de etanol al 40 % y ácido acético al 10 % en un agitador orbital a 50 rpm a temperatura ambiente 2 veces (cada uno durante 30 minutos), o durante la noche a 4 °C.
- Lave los geles 3 x 10 min cada uno en agua ultrapura en un recipiente limpio. El paso de lavado es crítico. Si el ácido de la solución de fijación no se elimina correctamente en el paso de desarrollo fluorogénico, el exceso de TPE-4TA será activado por el ácido y dará lugar a una fuerte fluorescencia de fondo en el gel.
3. Preparación de la solución de AgNO3 e impregnación de plata del gel
- Para hacer la solución de AgNO3 (0,0001%) para la impregnación, primero disuelva 0,01 g de AgNO3 en 10 mL de agua ultrapura para preparar una solución madre de AgNO3 al 0,1%. A continuación, agregue 100 μL de la solución madre de AgNO3 al 0,1% en 100 mL de agua ultrapura para hacer la solución >nota: La solución de AgNO3 debe almacenarse en la oscuridad antes de su uso.
- Impregnar el gel con 100 mL de solución de trabajo de plata durante 1 h en un agitador orbital a 50 rpm en un recipiente de vidrio sellado. Es fundamental realizar la impregnación de plata bajo una campana de gases, protegida de la luz con papel de aluminio.
- Lave el gel con agua ultrapura (unos 100 ml) en un recipiente limpio durante 2 x 60 s.
4. Desarrollo fluorogénico del gel
- Para preparar la solución madre de colorante (0,1 mM), añadir 3,0 mg del colorante TPE-4TA en 50 mL de agua ultrapura. Sonicar la solución durante unos minutos y añadir un poco de solución de NaOH (por ejemplo, 1 M) para ayudar a disolver el tinte.
- Verifique la fluorescencia de la solución bajo una lámpara UV de 365 nm para asegurarse de que la molécula de colorante se disuelva por completo. Solo las soluciones débiles o no emisivas indican la disolución completa.
nota: El colorante TPE-4TA se sintetizó siguiendo el protocolo reportado recientemente por Xie et al.La solución TPE-4TA es muy estable y se puede mantener en la oscuridad durante meses.
- Para preparar 100 mL de la solución de revelado fluorogénico (10 μM), agregue 10 mL de la solución madre TPE-4TA en 90 mL de agua ultrapura. Verifique el pH de la solución con un medidor de pH y ajústelo a 7 - 9 con una solución de hidróxido de sodio (1 μM).
- Transfiera el gel a un recipiente limpio y hermético con 100 ml de la solución reveladora fluorogénica. Asegúrate de que el gel esté totalmente sumergido en la solución. Selle el recipiente. Cúbralo de la luz y agítelo durante la noche en un agitador orbital a 50 rpm a temperatura ambiente. Alternativamente, el paso de incubación también se puede acortar a aproximadamente ~ 2 h precalentando la solución de desarrollo AIE a 80 °C para tinción y luego dejándola a temperatura ambiente.
5. Decoloración e imagen
- Transfiera el gel a un recipiente limpio y déjelo en 100 mL de etanol al 10% durante 30 min.
nota: Solo se puede usar agua para lavar el gel. Sin embargo, es más eficiente en el tiempo utilizar una solución de etanol al 10% para la decoloración. Esto ayudará a reducir el proceso de decoloración de horas a 30 minutos.
- Enjuague el gel en agua ultrapura durante 5 min.
- Visualice el gel en el canal de 365 nm o en el canal de 302 nm con una máquina de documentación de gel.