Tinción de gotas lipídicas de enocitos larvales de Drosophila: una técnica para la evaluación de la acumulación de gotas lipídicas en condiciones normales y estresadas utilizando un colorante a base de BODIPY

Resumen

Fuente: Wei, C., et al., Disección y tinción de gotas lipídicas de enocitos en larvas de Drosophila. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra la tinción de gotas de lípidos en enocitos larvarios de Drosophila - células similares a los hepatocitos - utilizando el colorante fluorescente lipofílico a base de BODIPY. Estas células actúan como modelo para estudiar el metabolismo de los lípidos durante el desarrollo y en respuesta al estrés ambiental, como la inanición.

Protocolo

1. Tratamiento de inanición para las larvas

NOTA: En las larvas del tercer estadio, hay pocas o ninguna gota de lípidos detectable en los enocitos en condiciones normales de alimentación, pero se pueden inducir numerosas gotas de lípidos grandes en los enocitos en condiciones de estrés, como la inanición. Para verificar aún más este método, es necesario pretratar estas larvas para inducir la biogénesis de las gotas de lípidos en los enocitos. Aquí, se eligió como paradigma un curso de tiempo de inanición de 12 h, 24 h y 36 h. En particular, un corto período de inanición (por ejemplo, 3 h) es suficiente para inducir gotas de lípidos detectables en los enocitos. La duración de la inanición puede variar de acuerdo con los objetivos y entornos experimentales específicos.

1. Hacer cámaras para tratamientos de inanición y control.
   1. Para cámaras de tratamiento de inanición: coloque un papel de filtro de tamaño adecuado en una placa de Petri de 6 cm y pipetee 1 mL de PBS sobre el papel de filtro.
   2. Para las cámaras de tratamiento de control: coloque 5 mL de alimento de harina de maíz estándar de Bloomington en la placa de Petri.
2. Use una espátula para desenterrar suavemente la capa superior de alimentos que contienen larvas que aún están excavando en la comida y transfiéralas a una placa de Petri llena de 5 ml de PBS. Revuelva suavemente las larvas en PBS para eliminar cualquier contaminación de alimentos de las larvas y hacerlo lo más limpio posible.
3. Usa un pincel pequeño para recolectar 40 larvas de tercer estadio del mismo tamaño aproximado. Clasifíquelos al azar en una cámara de inanición o de control, con 20 larvas cada uno.
4. Coloque las cámaras en la incubadora a 25 °C con 60% de humedad y permita el desarrollo durante 12 h, 24 h y 36 h de tratamiento.
   NOTA: Para las larvas en la cámara de inanición, agregue 1 mL de PBS cada 12 h para evitar la deshidratación de las larvas.

>2. Disección de Enocitos

1. Use un pincel pequeño para recoger las larvas de la edad adecuada (12 h, 24 h o 36 h después del tratamiento), luego transfiéralas a una nueva placa de Petri llena de 5 mL de PBS helado para lavar>NOTA: Repita el paso 2.2 cuando trate con larvas en una cámara de control para eliminar cualquier contaminación de alimentos.
2. Llene una placa de disección con PBS helado y use pinzas para transferir suavemente las larvas a la placa de disección. Coloque la placa de disección bajo un microscopio estereoscópico para el siguiente paso de disección.
   NOTA: La temperatura helada ayudará a ralentizar los movimientos de las larvas y facilitará la disección.
3. Gire las larvas con el lado ventral hacia arriba y el lado dorsal hacia abajo y manténgalas suavemente en su lugar con pinzas. Asegure las larvas a la placa >NOTA: El lado dorsal se identifica más fácilmente por la presencia de los troncos dorsales de la tráquea.
4. Use las tijeras de resorte Vannas para incidir (longitudinalmente) a través de la epidermis desde el extremo anterior hasta el posterior.
5. Extirpar el tejido interno de la epidermis con pinzas.
   NOTA: Se debe tener precaución al retirar las ramas traqueales para evitar daños en los enocitos, que se localizan en la superficie interna de la epidermis.
6. Con pinzas, recupere los clavos de disección y transfiera la epidermis a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml lleno de PBS en hielo.
7. Continúe diseccionando otras larvas siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.

>3. Tinción de gotas de lípidos

1. Incubar la epidermis disecada en el tampón de fijación durante 30 min a temperatura ambiente (RT) en un rotador.
   nota: El tampón de fijación contiene un 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS.
2. Retire el tampón de fijación, seguido de un lavado rápido. Para realizar un lavado rápido, agregue 1 mL de PBS en RT en el tubo después de la eliminación de PFA, resuspenda suavemente los tejidos y deseche el PBS.
   cautela: El tampón de fijación contiene PFA, que es perjudicial para la salud humana. Es importante desechar adecuadamente el tampón de fijación como residuo peligroso.
3. Lave las muestras 3 veces durante 5 minutos cada una con PBS para eliminar todos los posibles residuos de PFA.
4. Incubar la epidermis con BODIPY 493/503 (1 μg/mL; ver tabla de materiales) durante 30 min a RT en un rotador.
   nota: A partir de este paso, envuelva el tubo de microcentrífuga con un trozo de papel de aluminio para proteger las muestras de la luz y minimizar el posible fotoblanqueo.
5. Retire la solución de tinción BODIPY 493/503 y lave las muestras 3 veces durante 10 minutos cada una con PBS para eliminar completamente los tintes residuales.

>4. Montaje e imagen

1. Coloque 6 μL de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio limpio.
   nota: El medio de montaje se utiliza para un tiempo de detección más prolongado en función de sus propiedades antidecoloración.
2. Use fórceps para levantar una epidermis y retire suavemente el PBS residual con una toallita.
3. Coloque la epidermis en el medio de montaje y ajuste su orientación de modo que su superficie interna que contiene los enocitos esté en la parte inferior y su superficie externa en la parte superior.
4. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre la epidermis.
   nota: Retire cualquier medio de montaje adicional que se filtre por debajo del cubreobjetos con una toallita, si es necesario. Para facilitar la obtención de imágenes, empuje suavemente hacia abajo el cubreobjetos con pinzas para que, al observar el portaobjetos a través del microscopio, se pueda obtener fácilmente la imagen del grupo de enocitos en un solo plano. Alternativamente, es factible cortar la epidermis en dos semi-epidermis a través de la línea media para evitar el enrollamiento de toda la epidermis al montar los tejidos.
5. Aplica esmalte de uñas transparente alrededor de los bordes del cubreobjetos para sellar.
6. Coloque los portaobjetos en una caja de muestra a prueba de luz y deje que el esmalte de uñas se seque a RT, lo que puede tardar de 5 a 10 minutos.
7. Proceda con el análisis microscópico. Tome imágenes con un microscopio confocal (aumento de 63x con ajustes de filtro GFP o FITC optimizados, excitación = 488 nm, emisión = 503 nm) para adquirir señales limpias y sensibles con un fondo minimizado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de centrífuga de 50 mL	Corning	430829	50 mL
Placa de Petri de 6 cm	Termo Fisher	150326	6 cm
agar-agar			Para alimento para moscas
papel de aluminio	N/A	N/A	Proteger el arce de la luz
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Tinte para manchas de gotas de lípidos
Microscopio confocal	Leica	Leica TSC SP5	Imágenes confocales
Jarabe de maíz			Para alimento para moscas
harina de maíz			Para alimento para moscas
cubreobjetos	Citoglas	10212424C	20 × 20 mm, 0,13-0,17 de espesor
Alfiler de disección	N/A	N/A
Placa de disección	N/A	N/A
Papel de filtro	N/A	N/A	Diámetro: 11 cm
Tampón de fijación	N/A	N/A	4% de paraformaldehído (PFA) en 1x Pbs
Pinza	Dumont	11252-30	#5
incubadora	Jiangnan	SPX-380	Para el cultivo de moscas
Tubo de microcentrífuga	Axygen	MCT-150-C	1,5 ml
Portaobjetos de microscopía	Citoglas	10127105P-G
Medio de montaje	VECTASHIELDAntifade Mounting Medio	H-1000	Medio de montaje antidecoloración
esmalte	PanEra	AAPR419	Selle el cubreobjetos
pincel	N/A	N/A
Pbs	N/A	N/A	1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na_{2} HPO_{4}, 1.8 mM KH_{2} PO_{4}, pH 7.4)
músculo rotatorio	Instrumentos de laboratorio Kylin-Bell	WH-986
tijera	Smartdata Médico	SR81	Tijera de resorte Vannas
Harina de soja			Para alimento para moscas
espátula	N/A	N/A
Alimento estándar de harina de maíz	N/A	N/A	De acuerdo con el estándar de Bloomington Receta de comida de harina de maíz
Microscopio estereoscópico	Leica	Leica S6E	Para la disección de tejidos
Papel de limpieza	N/A	N/A
levadura			Para alimento para moscas