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1. Solución de tinción LCO
NOTA: Si hFTAA se compra a un proveedor comercial, siga las instrucciones del proveedor en lugar de la sección 1.
- Vuelva a suspender el hFTAA liofilizado en 2 mM de NaOH para preparar una solución madre de 1 mg/mL. Mantener el caldo en un vial de vidrio a 4 °C. El stock se puede almacenar durante un año.
- El día de la tinción, prepare una solución de trabajo diluyendo el material 1:10.000 en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
>2. Preparación de muestras de tejido
NOTA: Se pueden obtener imágenes de muchos tipos de tejidos utilizando hFTAA como marcador de amiloide. Consulte la Figura 1 para ver ejemplos. El hFTAA es sensible a la conformación de agregados. Por lo tanto, la tinción debe realizarse preferiblemente en agregados no interrumpidos sin exposición a epítopos. La calidad espectral óptima se logra si la fijación del tejido se mantiene al mínimo. Por lo tanto, se prefiere el material congelado fresco, fijado suavemente en etanol en el momento de la tinción. Sin embargo, también es posible detectar depósitos de amiloide en tejidos que se han fijado con, por ejemplo, formol. Por lo general, la hFTAA penetra bien en el tejido. Seleccione un grosor de muestra que sea compatible con la técnica de imagen prevista.
- Si se utilizan secciones fijadas en formol, incluidas en parafina, desparafinadas en xileno durante la noche. Sumerja las secciones en baños consecutivos de 99% de etanol, 70% de etanol, dH2O y PBS, 10 min en cada uno. Deje que las secciones de tejido se sequen en condiciones ambientales. Precaución: El xileno siempre se manipula en una campana de gases químicos. El xileno y otros disolventes orgánicos son perjudiciales.
- Descongele las criosecciones a temperatura ambiente. Fije las secciones de tejido en formalina al 10% durante la noche y rehidrátelas sumergiéndolas en baños consecutivos de etanol al 99%, etanol al 70%,dH2Oy PBS, 10 min en cada uno. Deje que las secciones de tejido se sequen en condiciones ambientales.
- Agregue gotas de la solución de trabajo de hFTAA (aproximadamente 200 μL) a las secciones de tejido para cubrirlo. La gota debe permanecer en su lugar por la tensión superficial. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente para teñir.
- Enjuague la solución de tinción con 500 μL de PBS con una pipeta y luego sumerja el portaobjetos en el baño de PBS durante 10 min. Deje que la sección se seque en condiciones ambientales.
- Montaje utilizando el medio de montaje de fluorescencia. Permita que el medio de montaje se asiente durante la noche.
NOTA: La tinción con hFTAA se puede realizar en combinación con otros métodos de tinción como inmunofluorescencia, marcadores específicos de células u orgánulos, etc. Para realizar la tinción conjunta, ejecute el protocolo de tinción completo de su elección y agregue la tinción hFTAA al final, comenzando desde el paso 2.2. Consulte la Figura 2 para ver ejemplos. Para la inmunofluorescencia, preferiblemente seleccione un anticuerpo secundario que se excite a 640 nm o más. En este rango de longitud de onda, el hFTAA no absorbe y, por lo tanto, no puede excitarse y no emitirá fluorescencia. Esto asegura que no se vea sangrado entre el hFTAA y el anticuerpo.
