Tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato: una técnica in vitro para detectar osteoclastos cultivados que contienen la enzima TRAP

Resumen

Fuente: Dai, Q., et al. Un ensayo de cultivo de osteoclastos basado en < href="https://www.jove.com/v/56468">RANKL de médula ósea de ratón para investigar el papel de mTORC1 en la formación de osteoclastos. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra la técnica de tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato para detectar la presencia de gránulos que contienen TRAP dentro de los osteoclastos. La técnica forma depósitos de gránulos de colorante de color magenta en el citoplasma de los osteoclastos, haciéndolos visibles bajo un microscopio invertido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación

1. Genere ratones de deleción de Raptor específicos de osteoclastos (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, en adelante Rap^Ctsk) mediante el apareamiento de ratones Raptor^fl/fl con ratones Ctsk-cre. En este estudio, utilice los ratones ^{Raptor fl/fl} como control WT.
2. Tenga un recipiente con hielo para mantener el hueso aislado.
3. Preparar el medio de cultivo.
   1. Prepare α medio de cultivo MEM suplementando el medio esencial mínimo alfa (α-MEM) con 1x glutamina, penicilina-estreptomicina y suero fetal de ternero al 10%.
   2. Prepare un medio de inducción de macrófagos en médula ósea que consista en 50 mL de medio α-MEM y M-CSF a 20 ng/mL.
   3. Prepare el medio de inducción de osteoclastos que consiste en M-CSF y RANKL a 20 ng/mL, respectivamente, en 50 mL de medio α-MEM.
4. Prepare los siguientes tampones antes de la tinción TRAP.
   1. Prepare una solución fija que consta de 6,5 mL de acetona, 2,5 mL de solución de citrato y 0,8 mL de solución de formaldehído al 37% (vol/vol).
   2. Prepare la solución de tinción TRAP.
      1. Precalentar el agua desionizada a 37 °C.
      2. Añadir 100 μL de solución base de granate rápido GBC y 100 μL de solución de nitrito de sodio en un microtubo de 1,5 mL y mezclar por inversión suave durante 30 s. Dejar reposar la mezcla durante 2 min.
      3. Precalentar 9 mL de agua desionizada a 37 °C. Añadir 200 μL de solución base de granate rápido desazotizado GBC del paso 1.4.2.2, 100 μL de solución de fosfato de naftol AS-BI, 400 μL de solución de acetato y 200 μL de solución de tartrato.
      4. Mantenga la solución de mezcla de tinción TRAP en un baño de agua a 37 °C.

>2. Disección (Día-1)

1. Eutanasia de 3 ratones hembra WT y Rap^Ctsk de un mes de edad por CO₂ por separado. Realice la inhalación de CO₂ con el equipo adecuado por personal capacitado.
2. Sumerja 6 ratones en un vaso de precipitados con 100 mL de etanol al 75% (vol/vol) durante 5 minutos para evitar la contaminación bacteriana y luego colóquelos en una tabla de disección en posición supina. Hacer una incisión vertical en la parte distal de la tibia y diseccionar la piel a lo largo de la extremidad posterior con unas tijeras oftálmicas.
3. Cortar el ligamento articular de la articulación de la cadera con unas tijeras y dislocar las extremidades traseras del tronco.
4. Cortar el ligamento articular de la articulación de la rodilla y disociar cuidadosamente la tibia y el fémur de la articulación de la rodilla. Retire suavemente el tejido blando con unas tijeras.
5. Coloque todos los huesos de un genotipo en un ratón en cada pocillo de una placa de seis pocillos con 2 mL de α-MEM en hielo.
   nota: Para preservar la viabilidad celular, el hueso debe mantenerse en estas condiciones durante menos de 1 h.

3. Aislamiento (Día-1)

1. Llene un pocillo de una placa de seis pocillos con etanol al 75% (3 mL) y los otros 5 pocillos con medio α-MEM (3 mL).
2. Coloque todos los huesos de un genotipo en el lavado con etanol durante 15 s y lave los huesos 5 veces con medio α-MEM durante 10 s cada vez.
3. Corte las epífisis con la tijera e inserte una aguja de jeringa de 0,45 mm en la cavidad ósea y enjuague la médula con medio α-MEM en un tubo de centrífuga de 50 ml.
4. Enjuague la cavidad ósea usando el mismo método desde el otro extremo del hueso. Repita al menos dos veces para lavar bien la cavidad ósea hasta que el hueso esté pálido.
5. Centrifugar la médula ósea para obtener un pellet celular a 800 x g y 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
6. Agregue 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos en el tubo de centrífuga y pipetee suavemente para resuspender la médula ósea. Mantenga el tubo de centrífuga en hielo durante 8 minutos para lisar los glóbulos rojos.
7. Agregue 6 ml de medio α-MEM en el tubo de centrífuga para detener la lisis celular. Centrifugar a 500 x g y 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante.
8. Vuelva a suspender en 3 mL de medio de cultivo α-MEM y coloque las células en una placa de seis pocillos (generalmente un ratón por pocillo).
9. Incubar a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ durante la noche.

>4. Enchapado (Día 0)

1. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 15 ml para recoger las células no adheridas a la mañana siguiente.
2. Centrifugar a 800 x g y 4 °C durante 5 min y aspirar el sobrenadante.
3. Vuelva a suspender en 4 mL de medio de cultivo α-MEM.
4. Tome 20 μL de la solución celular y mezcle con 20 μL de Azul de Tripán. Agregue 10 μL de la mezcla a la cámara de conteo y obtenga el recuento de células por mL de solución.
5. Añadir un volumen adecuado de medio de cultivo α-MEM para obtener una solución celular de 500.000 células/mL.
6. Agregue 500 μL y 50 μL de medio de inducción de macrófagos de médula ósea en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y una placa de 96 pocillos, respectivamente.
7. Agregue 500 μL y 50 μL de solución celular en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y una placa de 96 pocillos, respectivamente.
8. Incubar a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ durante 3 días.

5. Diferenciación (Días 3-7)

1. Tres días después de la siembra, recoja 50 μL de medio de cada pocillo de la placa de 96 pocillos y congele a -20 °C, y luego aspire el medio residual.
2. Agregue 1 mL y 100 μL de medio de inducción de osteoclastos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y una placa de 96 pocillos, respectivamente.
3. Incubar a 37 °C durante 2 días.
4. Recoja 50 μL de medio de cada pocillo y aspire el medio residual.
5. Agregue medio de inducción de osteoclastos en cada pocillo.
6. Incubar a 37 °C durante 1 día.
   nota: En este momento, los osteoclastos grandes y multinucleados deben observarse bajo un microscopio invertido (Figura 1A).
7. Si no se observan osteoclastos, se debe cambiar el medio de inducción de osteoclastos y observar diariamente hasta que se vean osteoclastos.
8. Recoja 50 μL de medio de cada pocillo de la placa de 96 pocillos después de que se hayan formado los osteoclastos.

>6. Tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP)

NOTA: Los osteoclastos maduros pueden estar presentes después de 6-7 días de cultivo in vitro (paso 4).

1. Aspire medio y lave suavemente 3 veces con 1x PBS.
2. Fije las celdas en cada pocillo de la placa de 96 pocillos con 100 μL de solución fija durante 30 s a temperatura ambiente.
3. Después de la fijación, aspirar la solución fija y lavar suavemente 3 veces con agua desionizada precalentada a 37 °C. Aspirar agua desionizada.
4. Añada 100 μL de tinción TRAP en cada pocillo de la placa de 96 pocillos y coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 30 min y protéjala de la luz.
5. Después de la tinción, aspire la mancha TRAP y lave suavemente 3 veces con agua desionizada.
6. Imágenes de osteoclastos utilizando un microscopio invertido con un aumento de 40X.

Resultados

Figura 1: Vista representativa de los osteoclastos.(A) Osteoclastos gigantes observados en campo claro en el día 6. La línea roja delineaba el borde de los osteoclastos. (B) Un osteoclasto típicamente gigante, multinucleado, TRAP positivo (rojo vino). La flecha negra indicaba dos núcleos del osteoclasto multinucleado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones Raptorfl/fl	El Laboratorio Jackson	13188
Ratones Ctsk-cre			un regalo de S. Kato, Universidad de Tokio, Tokio, Japón
α-MEM	Corning	10-022-CVR
glutamina	Gibico	25030081
Penicilina estreptomicina	Gibico	15140122
Suero fetal de ternera	BioInd	04-001-1A
Proteína M-CSF recombinante de ratón	I+d	Q3U4F9
Proteína RANKL recombinante de ratón	I+d	Q3TWY5
Tampón de lisis de glóbulos rojos	Beyotime	C3702
Azul de tripano	Sigma-Aldrich	302643
acetona	Shanghái Química Co., Ltd.
Solución de citrato	Sigma-Aldrich	915
Solución de formaldehído	Shanghái Química Co., Ltd.
Kit de fosfatasa ácida, leucocitos (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Solución rápida de base de granate GBC	Sigma-Aldrich	3872
Solución de nitrito de sodio	Sigma-Aldrich	914
Solución de fosfato de naftol AS-BI	Sigma-Aldrich	3871
Solución de acetato	Sigma-Aldrich	3863
Solución de tartrato	Sigma-Aldrich	3873
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Corning	21-031-CVR
37% formaldehído	Xilong científico
IX71	Olimpo
Jeringa de 0,45 mm
tijera
Pinza para mosquitos