Tinción con rojo de alizarina: una técnica para visualizar la mineralización por osteoblastos cultivados

Resumen

Fuente: Kampleitner, C., et al. Perfil de compatibilidad biológica en biomateriales para la regeneración ósea. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra una técnica de tinción para detectar el grado de mineralización o deposición de calcio en osteoblastos primarios cultivados utilizando el colorante rojo de alizarina.

Protocolo

1. Mineralización de osteoblastos (OB) evaluada mediante tinción con Alizarin Red S (ARS)

1. Agregue osteoblastos primarios (OB) a los discos de fosfato β-tricálcico (β-TCP) utilizados como andamio biocompatible en una placa de cultivo.
2. Aspire el medio de cultivo de los pocillos que contienen OB primarios 14 días después de la adición del medio de mineralización y enjuague dos veces con 0,5 mL de 1x PBS en RT. Aspire el PBS y fije las células agregando 0,5 mL de la solución de formalina tamponada al 10% en RT durante 10 min.
3. Aspirar el formol tamponado al 10% con una pipeta de un solo uso y lavar dos veces con 0,5 ml de agua ultrapura.
4. A los OB fijos, añadir 0,25 mL de 40 mM de solución de tinción ARS (pH 4,2) disuelta en agua ultrapura e incubar la placa a RT durante 10 min en un agitador a 100 batidos/min.
5. Aspire la solución de tinción con una pipeta de un solo uso y enjuague con 1 ml de agua ultrapura. Repita este paso de 5 a 10 veces para eliminar las tinciones inespecíficas.
   nota: La solución de enjuague debe no tener color.
6. Aspirar el agua ultrapura y añadir 1 mL de PBS frío. Incubar la placa en RT durante 10 min en un agitador a 100 batidos/min.
7. Aspire el PBS, transfiera los discos β-TCP teñidos a un nuevo pozo y escanee las placas con un escáner plano para registrar la mineralización.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Discos de fosfato tricálcico β (β-TCP, 14 mm)			Los discos se sinterizaron en un horno de mufla a una temperatura de 1150 °C. Una descripción detallada de la producción se puede encontrar en Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Las muestras fueron irradiadas con rayos UV (15 min para cada lado) antes de su uso en cultivos celulares.
Espuma Orthovita Vitoss (espuma β-TCP/C)	Orthovita	Años 2102-1405
Alizarina Rojo S	Sigma-Aldrich	A5533
Solución de formalina neutra tamponada al 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Medio de mineralización osteogénico (MM)			α-MEM + 10% FBS inactivado por calor + 1% penicilina-estreptomicina + 50 μg/mL de ácido ascórbico + 5 mM β-glicerofosfato
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Agua ultrapura: Libre de pirógenos en agua de cultivo celular	VWR	L0970-500
Tampón de lavado			Agregue 0.05% Tween20 a 1x PBS.
Placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos	Greiner bio-one	662102
Escáner de cama plana: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Pipeta de un solo uso: pipeta de suero	Greiner bio-one	612301
agua destilada	Carl Roth	3478.4
Pipeta de un solo uso: pipeta de suero	Greiner bio-one	612301