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1. Protocolo de tinción de plata
- Prepare con anticipación todas las soluciones necesarias para la tinción de plata (Tabla 1).
nota: No toque directamente el gel PAGE hasta que se haya manchado, revelado y colocado en la solución de parada. En su lugar, manipule el gel con herramientas limpias de plástico o vidrio. La manipulación directa del gel dará lugar a distorsiones de las huellas dactilares y otros artefactos visibles en el gel después de la tinción.
- Una vez finalizada la ejecución, desmonte el casete y extraiga el gel en un recipiente limpio, mediano-grande, lleno de agua desionizada y filtrada.
nota: Para evitar manipular directamente el gel, use la punta de la pipeta u otro objeto de plástico para despegar suavemente el gel del casete mientras está sumergido en agua. El gel puede ser frágil, manéjelo con cuidado.
- Deseche el agua. Tiñe el gel con una solución de tinción de azul alcián durante 5 min.
- Deseche la mancha azul alcián. Enjuague/lave rápidamente 2-3 veces con agua desionizada y filtrada hasta que se haya eliminado la mayor parte de la solución de tinción de azul alcián.
- Deje que se elimine la mancha en agua desionizada y filtrada durante la noche en el balancín. Asegúrese de que haya un amplio volumen de agua desionizada y filtrada para garantizar que cualquier mancha residual se lave completamente del gel durante la noche.
- Gel de lavado en metanol al 50% (40 min en total, cambiar la solución 2-3x).
- Lave el gel en agua desionizada y filtrada durante 30 min. Deseche el agua y repita 3 veces más durante un total de 2 h, reemplazando el agua cada vez.
- En un recipiente limpio y nuevo, tiñe el gel durante 30 minutos en una solución de tinción de nitrato de plata.
- Enjuague / lave rápidamente 2-3 veces con agua desionizada y filtrada para eliminar por completo la solución de tinción de plata.
- Lavar durante 30 min en agua desionizada y filtrada. Deseche el agua y repita 2 veces durante un total de 90 minutos, reemplazando el baño de agua cada vez.
- Deseche el agua y agregue la solución reveladora.
- Una vez que se agrega la solución en revelado, observe cuidadosamente el gel y observe la apariencia de las bandas. Dependiendo de la calidad de la tinción y de la masa de la muestra cargada, el revelado puede tardar desde unos pocos segundos hasta varios minutos.
- Tan pronto como las bandas deseadas sean visibles, deseche inmediatamente la solución en desarrollo y lave brevemente con la solución de parada.
- Deseche la solución de parada, lave y reemplácela con una solución de parada nueva. Deje en remojo durante 1 h en una mecedora o coctelera.
- Lave con agua desionizada y filtrada durante la noche (sin embargo, el gel se puede visualizar inmediatamente después de detener el lavado con solución).
Tabla 1: Soluciones necesarias para la tinción con plata de glicosaminoglicanos separados por electroforesis en gel de poliacrilamida. Todas las soluciones deben filtrarse (0,22 μm) antes de su uso.
| NOTA: Todas las soluciones deben filtrarse (0.22μm) antes de su uso. |
| solución | receta | composición | Comentarios |
| Solución de tinción de azul alcián (500mL) | Polvo azul alcián 8GX | 2,5 g | Concentración deseada: 0,5% p/v |
| 2% v/v de ácido acético glacial | 500 ml | |
| Tinción de plata (200 mL) | Agua desionizada | 192.7 mL | Prepare la solución para manchas fresca; úsela dentro de una semana. |
| Hidróxido de sodio 7.6M | 2 mL | Para hacerlo, agregue 3,04 g de gránulos de hidróxido de sodio a 10 ml de agua |
| Hidróxido de amonio | 3.3 mL | |
| Solución de nitrato de plata 4M | 2 mL | Para hacerlo, agregue 3.397 g de nitrato de plata a 5 mL de agua. Agregue gota a gota mientras revuelve para evitar la precipitación. |
| Solución en desarrollo (501 mL) | Agua desionizada | 500 mL | La solución en desarrollo debe hacerse fresca y usarse dentro de las 24 horas. |
| 2,5% p/v de ácido cítrico | 1 mL | Para hacerlo, agregue 100 mg a 4 ml de agua desionizada. El ácido cítrico debe elaborarse fresco. |
| Formaldehído | 250μL | |
| Solución de parada (500 mL) | Agua desionizada | 300 mL | |
| Ácido acético glacial | 20 mL | |
| metanol | 90 mL | |