Tinción de plata de glicosaminoglicanos sulfatados: un método de tinción para la visualización de glicosaminoglicanos sulfatados en geles de poliacrilamida

1. Protocolo de tinción de plata

1. Prepare con anticipación todas las soluciones necesarias para la tinción de plata (Tabla 1).
   nota: No toque directamente el gel PAGE hasta que se haya manchado, revelado y colocado en la solución de parada. En su lugar, manipule el gel con herramientas limpias de plástico o vidrio. La manipulación directa del gel dará lugar a distorsiones de las huellas dactilares y otros artefactos visibles en el gel después de la tinción.
2. Una vez finalizada la ejecución, desmonte el casete y extraiga el gel en un recipiente limpio, mediano-grande, lleno de agua desionizada y filtrada.
   nota: Para evitar manipular directamente el gel, use la punta de la pipeta u otro objeto de plástico para despegar suavemente el gel del casete mientras está sumergido en agua. El gel puede ser frágil, manéjelo con cuidado.
   1. Deseche el agua. Tiñe el gel con una solución de tinción de azul alcián durante 5 min.
   2. Deseche la mancha azul alcián. Enjuague/lave rápidamente 2-3 veces con agua desionizada y filtrada hasta que se haya eliminado la mayor parte de la solución de tinción de azul alcián.
   3. Deje que se elimine la mancha en agua desionizada y filtrada durante la noche en el balancín. Asegúrese de que haya un amplio volumen de agua desionizada y filtrada para garantizar que cualquier mancha residual se lave completamente del gel durante la noche.
   4. Gel de lavado en metanol al 50% (40 min en total, cambiar la solución 2-3x).
   5. Lave el gel en agua desionizada y filtrada durante 30 min. Deseche el agua y repita 3 veces más durante un total de 2 h, reemplazando el agua cada vez.
   6. En un recipiente limpio y nuevo, tiñe el gel durante 30 minutos en una solución de tinción de nitrato de plata.
   7. Enjuague / lave rápidamente 2-3 veces con agua desionizada y filtrada para eliminar por completo la solución de tinción de plata.
   8. Lavar durante 30 min en agua desionizada y filtrada. Deseche el agua y repita 2 veces durante un total de 90 minutos, reemplazando el baño de agua cada vez.
   9. Deseche el agua y agregue la solución reveladora.
   10. Una vez que se agrega la solución en revelado, observe cuidadosamente el gel y observe la apariencia de las bandas. Dependiendo de la calidad de la tinción y de la masa de la muestra cargada, el revelado puede tardar desde unos pocos segundos hasta varios minutos.
   11. Tan pronto como las bandas deseadas sean visibles, deseche inmediatamente la solución en desarrollo y lave brevemente con la solución de parada.
   12. Deseche la solución de parada, lave y reemplácela con una solución de parada nueva. Deje en remojo durante 1 h en una mecedora o coctelera.
   13. Lave con agua desionizada y filtrada durante la noche (sin embargo, el gel se puede visualizar inmediatamente después de detener el lavado con solución).

Tabla 1: Soluciones necesarias para la tinción con plata de glicosaminoglicanos separados por electroforesis en gel de poliacrilamida. Todas las soluciones deben filtrarse (0,22 μm) antes de su uso.