1. Siembra para cultivo de células de expansión y placas CFU
- Resuspender las células (formadas por eritrocitos y células mononucleares) en 50 ml de medio basal: Alpha-MEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 2,5 mg/ml de anfotericina B. Contar las células diluidas 1:10 en una solución de Azul de Trypan utilizando una cámara de Neubauer.
- Colocar las células en matraces de cultivo celular a una densidad de 5 x 10⁷ células/cm² e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C. Si está disponible, use condiciones hipóxicas (5% de oxígeno). Para el control del ensayo CFU, coloque 10⁹ células en una placa de cultivo celular de 10 cm de diámetro.
- Después de 3 días de cultivo, las células madre mesenquimales se unen a la placa de cultivo celular mientras que otras células permanecen en suspensión. Cambie el medio por medio basal suplementado con 5 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF). Para el control del ensayo de UFC, trate la placa de cultivo celular de la misma manera.
- Continúe el cultivo celular durante un total de 2 semanas, intercambiando medios tres veces por semana. Si las células superan el 80% de confluencia, se dividen por tripsinización. Para el control del ensayo CFU, intercambie los medios de la misma manera, pero no divida las células en el transcurso de las dos semanas.
>2. Tinción de Giemsa para ensayo de UFC
- Preparar 10 ml de solución de Giemsa por plato: diluir la solución madre (7,6 g/l de Giemsa en glicerol:metanol) 1:10 en agua estéril (preparar siempre una dilución de trabajo fresca).
- Retire los medios de la placa de cultivo celular y lave las células con PBS. Tenga mucho cuidado al aplicar líquido a la placa de Petri y evite lavar las células.
- Fije las células en metanol puro durante 5 min a RT. Deseche el metanol. Añadir la solución de Giemsa e incubar durante 60 min en una incubadora humidificada a 37 °C.
- Lavar dos veces con PBS. Seque al aire la cabeza del plato primero sobre una toalla de papel. Cuenta las colonias manualmente. Esto se logra mejor usando un rotulador en la parte posterior de la placa.