NOTA: Los aspirados de médula ósea canina de la cresta ilíaca se recolectaron con el consentimiento del dueño del perro. Los aspirados de médula ósea canina (aprox. 10 ml) se anticoagularon mediante la adición de 15 ml de citrato de sodio al 3,8% inmediatamente después de la retirada en el quirófano. Las muestras se transfirieron al laboratorio para su procesamiento el mismo día de su retirada.
>1. Preparación de la uroquinasa (antes del1er uso)
- Reconstituya la uroquinasa con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante: Añada 10 ml de PBS al matraz de entrada del tabique con una jeringa de 10 ml. Disolver la sustancia seca mediante remolino para obtener 50.000 unidades de inyección (U) por ml.
- Prepare 500 μl de alícuotas (25.000 U cada una) en tubos estériles. Almacene las alícuotas a -20 °C y utilícelas cuando sea necesario durante al menos 6 meses.
>2. Pasos preparatorios (antes de cada tratamiento de médula ósea)
- Descongelar una alícuota de uroquinasa (25.000 U) por aspirado de médula ósea coagulado (se han tratado con éxito volúmenes de aspirado de hasta 25 ml utilizando una sola alícuota de 25.000 U).
- Precalentar un baño de agua o una incubadora agitadora a 37 °C.
>3. Digestión enzimática del coágulo
- Realice todo el trabajo en una cabina de bioseguridad de flujo laminar para evitar la contaminación microbiana de las muestras de médula ósea durante el procesamiento. Cuando se trabaja con material humano potencialmente infeccioso, se aconseja el uso de guantes protectores, así como una manipulación cuidadosa.
- Coloque un colador de células de 100 μm encima de un tubo estéril de 50 ml. Vierta con cuidado el aspirado de médula ósea a través del filtro de células, inclinando el filtro o moviéndose alrededor del material del coágulo. Utilice una punta de pipeta estéril para un mejor flujo a través de la malla del filtro.
nota: Evite cualquier dilución del coágulo, por ejemplo, lavando el coágulo con PBS. La uroquinasa actúa indirectamente y requiere componentes del suero (es decir, plasminógeno) de la biopsia para una digestión eficaz. Mientras continúa el procedimiento con el material del coágulo, el filtrado se puede mantener en RT hasta su uso posterior en el paso 3.6.
- Transfiera el material del coágulo de médula ósea a una placa de cultivo celular vacía con pinzas estériles. Corta los restos en trozos pequeños de aproximadamente 2mm3 con un bisturí estéril.
- Transfiera los trozos pequeños del coágulo a un tubo de reacción de 50 ml con las pinzas estériles. Asegúrese de que el coágulo picado tenga una apariencia húmeda. Si parece estar seco, use un poco del filtrado del paso 3.1 para humedecer.
- Triture el coágulo pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante 5 veces con una pipeta de microtitulación de 5 ml. Añadir 1 alícuota de uroquinasa a la muestra. Incubar durante 30 minutos a 37 °C, ya sea en un baño de agua o en una incubadora agitada (suavemente).
- Triturar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una pipeta de 5 ml. Realice este paso en un gabinete de bioseguridad. Incubar durante otros 30 minutos a 37 °C. Después de la incubación, triturar de nuevo 5 veces con una pipeta de 5 ml. Pase sobre un filtro de células nuevo de 100 μm para agrupar con el filtrado del paso 3.2.
- Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 10 min a 500 x g. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo de célula en un medio como se describe a continuación o de acuerdo con el procedimiento estándar de su laboratorio para el cultivo de expansión de MSC.
>4. Siembra para cultivo de células de expansión y placas CFU
- Resuspender las células (formadas por eritrocitos y células mononucleares) en 50 ml de medio basal: Alpha-MEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 2,5 mg/ml de anfotericina B. Contar las células diluidas 1:10 en una solución de Azul de Trypan utilizando una cámara de Neubauer.
- Colocar las células en matraces de cultivo celular a una densidad de 5 x 107 células/cm2 e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C. Si está disponible, use condiciones hipóxicas (5% de oxígeno). Para el control del ensayo CFU, placa 109 células en una placa de cultivo celular de 10 cm de diámetro.
- Después de 3 días de cultivo, las células madre mesenquimales se unen a la placa de cultivo celular mientras que otras células permanecen en suspensión. Cambie el medio por medio basal suplementado con 5 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF). Para el control del ensayo de UFC, trate la placa de cultivo celular de la misma manera.
- Continúe el cultivo celular durante un total de 2 semanas, intercambiando medios tres veces por semana. Si las células superan el 80% de confluencia, se dividen por tripsinización. Para el control del ensayo CFU, intercambie los medios de la misma manera, pero no divida las células en el transcurso de las dos semanas.
5. Diferenciación MSC
- Diferenciación de MSCs caninos
nota: Las MSC caninas se diferenciaron en linajes condrogénicos, osteogénicos y adipogénicos mediante estimulación con los medios apropiados durante cuatro semanas.
- Diferenciación condrogénica
- Cubos cortados (3 mm por lado) de un dispositivo médico en forma de esponja, constituido a partir de colágeno liofilizado tipo I, y utilizado como material de andamio para sostener las células.
- Siembre las MSC en la parte superior de los cubos a una concentración de 4 x 106 células/ml (~70.000 células/cubo).
- Antes de agregar el medio, deje que las células se adhieran a los cubos durante 30 minutos.
- Mantener las construcciones de colágeno MSC en medios condrogénicos que consisten en DMEM/F12 + GlutaMAX, 2,5 % FBS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 2,5 μg/ml de anfotericina B, 40 ng/ml de dexametasona, 50 μg/ml de ácido ascórbico 2-fosfato, 50 μg/ml de L-prolina, 1x insulina-transferrina-selenio X y 10 ng/ml de factor de crecimiento transformante-β1.
- Utilice la tinción con azul alcián para visualizar la acumulación de proteoglicanos en las secciones de construcción. Brevemente, tiñe las secciones O/N con azul alcián al 0,4% disuelto en 0,01% H2SO4 y clorhidrato de guanidina 0,5M. A continuación, se lavaron las secciones durante 30 min en 40% de DMSO y 0,05M MgCl2. Las células se contratiñeron con rojo nuclear rápido.
