Tinción de Sudán IV: Un procedimiento para teñir placas ateroscleróticas cargadas de lípidos en el arco aórtico de ratón extraído

Resumen

Fuente: Centa, M., et al. Cuantificación de la aterosclerosis en ratones. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra un procedimiento que utiliza la tinción Sudán IV para teñir los depósitos de grasa en el arco aórtico del ratón extraído para visualizar las placas ateroscleróticas y determinar el alcance de la aterosclerosis.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE

>1. Análisis facial del arco aórtico y la arteria braquiocefálica

1. Prepare los lechos de alfiler para el análisis de la cara de los arcos aórticos. Doble un segmento de película de cera de parafina ocho veces para hacer una superficie plana de 25 mm x 25 mm. Envuélvelo con cinta aislante eléctrica negra para crear un fondo oscuro para la aorta. Coloque una etiqueta en la parte posterior de la cama de alfileres y use un lápiz de mina para escribir el número de identificación del mouse (la tinta de bolígrafo normal desaparecerá en el proceso de manchado).
2. Transfiera el arco aórtico al lecho de alfileres y coloque una gota de PBS encima. Comience a limpiar la aorta del tejido adiposo periadvential restante bajo un microscopio estereoscópico.
   1. Use las tijeras Vannas y las pinzas Dumont para despegar suavemente todo el tejido adiposo circundante sin manipular ni dañar la aorta. El Sudán IV teñirá el tejido adiposo de manera brillante y es crucial eliminar todo ese tejido en este punto.
      nota: Mantenga la aorta húmeda en todo momento, aplicando PBS adicional cuando sea necesario.
3. Abra la aorta en el plano coronal introduciendo las tijeras Vannas en la luz aórtica para exponer la superficie íntima. Comience a cortar la curvatura externa del arco ascendente en dirección distal y continúe cortando las ramas, incluida la arteria braquiocefálica. Conserva la parte dorsal de la región torácica descendente.
   1. Corta la curvatura menor y dobla la aorta para mostrar la superficie intimal.
      nota: Este paso requiere habilidades motoras finas y necesita algo de práctica para dominarlo.
4. Sujete el arco abierto a la cama de alfileres con el extremo romo de los alfileres de insectos minuciosos. Use un portaagujas micro Castroviejo para colocar los alfileres en su lugar. Doble suavemente los alfileres para alejarlos de la muestra cuando estén en su lugar. Sujete la aorta con alfileres sobre la cama sin estirar la muestra. Guarde el arco clavado mirando hacia abajo en una placa de Petri llena de PBS a 4 °C.
   nota: El protocolo se puede pausar aquí.
5. Preparar una solución de trabajo de Sudán IV. Mezcle 1 g de polvo de Sudán IV, 100 ml de etanol al 70% y 100 ml de acetona en una botella oscura y revuelva suavemente durante 10 minutos. No es necesario filtrar la solución y se puede usar durante un par de meses si se mantiene oscura a temperatura ambiente. Si el color de tinción no es satisfactorio, se puede hacer una nueva solución y volver a teñir las muestras.
   cautela: La acetona es un líquido inflamable que puede causar irritación ocular grave. Almacene en un lugar bien ventilado y tome medidas de precaución al manipularlo.
6. Coloque cinco placas de Petri en la mesa del laboratorio: una llena con etanol al 70%, una llena con solución de trabajo Sudan IV, dos llenas con etanol al 80% y una llena con PBS.
   1. Comience enjuagando la muestra en etanol al 70% durante 5 minutos colocando el lecho de fijación en la primera placa de Petri con el arco hacia abajo. Transfiera la muestra a la solución de trabajo Sudan IV y deje que tiña el arco durante 7 min.
   2. A continuación, enjuague con etanol al 80% durante 3 minutos dos veces para detener la superficie íntima normal. El tiempo de decoloración se puede ajustar para optimizar los resultados. Por último, enjuague en PBS antes de volver a colocar la muestra en la placa de Petri original.
7. Adquiera micrografías utilizando un microscopio estereoscópico con un aumento de 10 veces conectado a una cámara digital. Tome fotografías del arco clavado sumergido en PBS utilizando pequeños pesos de metal (20 mm x 10 mm x 5 mm) para sujetar el lecho de alfiler al fondo de una placa de Petri.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cinta aislante eléctrica negra (50 mm de ancho)	Cualquier minorista especializado		Para crear lechos de fijación para arcos aórticos.
Tijeras de disección (10 cm, rectas)	Instrumentos de precisión mundial	Año 14393	Para la disección general de órganos.
Pinza Dumont #5 (11 cm, recta)	Instrumentos de precisión mundial	500341	Para la microdisección de la aorta.
Etanol 70% (v/v)	Productos químicos de VWR	83801.29	Líquidos y vapores altamente inflamables, almacene en un lugar bien ventilado y manténgalo fresco.
Etanol absoluto ≥99,8%	Productos químicos de VWR	20821.31	Líquidos y vapores altamente inflamables, almacene en un lugar bien ventilado y manténgalo fresco.
Formaldehído 4% estabilizado, tamponado (pH 7,0)	Productos químicos de VWR	9713.1	Nocivo por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere.
Isopropanol	Merck	1096341011	Líquido inflamable, causa irritación ocular grave y puede causar somnolencia o mareos.
Portaagujas Micro Castroviejo (9 cm, recto)	Instrumentos de precisión mundial	503376	Para la fijación de arcos aórticos.
Clavijas para insectos, 0,10 mm	Herramientas de Bellas Ciencias	26002-10	Para la fijación de arcos aórticos.
Parafilm M	Bemis	PM992	Película de cera de parafina utilizada para crear lechos de alfiler para arcos aórticos.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	-	-	Se requiere una solución estéril y libre de RNasa para la perfusión de ratones
Microscopio estereoscópico	Microsistemas Leica	MZ6	Para disección y documentación presencial
Sudán IV	Sigma-Aldrich	S4261	No clasificado como sustancia o mezcla peligrosa.
Tijera Vannas (8 cm, recta)	Instrumentos de precisión mundial	503378	Para la microdisección de la aorta.