Tinción con blanco de calcoflúor: un método simple para la visualización de fluorescencia inducida por UV de depósitos de celulosa en las paredes celulares de secciones de tallo de plantas dicotiledóneas

Resumen

Fuente: Pradhan M. et al. Tinción histoquímica de elementos secundarios de la pared celular de Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2014)

En este video, describimos un procedimiento de tinción para visualizar la deposición de celulosa dentro de las paredes celulares de Arabidopsis thaliana, una planta dicotiledónea, utilizando blanco de calcofluor, que se une específicamente a los glucanos ligados a β, exhibiendo fluorescencia bajo luz UV.

Protocolo

1. Incrustación de tallo

1. Preparar una solución de agarosa al 7% en agua (7 g de agarosa apta para electroforesis en 100 ml de agua destilada). Disuelva la agarosa esterilizándola en autoclave durante 20 minutos o calentándola en el microondas durante 20 minutos a la intensidad más baja (por ejemplo, 10% de intensidad de un microondas de 1,250 vatios).
2. Prepara un molde casero para incrustar los tallos con viales de plástico.
   1. Con una cuchilla de afeitar, corte la parte inferior cónica de un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de 2 ml (Parte A). Con una aguja de jeringa, perfore un agujero en la tapa del tubo ligeramente mayor que el diámetro del vástago que se va a incrustar. A continuación, corte 0,5 cm del fondo de un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (Parte B).
   2. Añada la porción de 0,5 cm del tubo de microcentrífuga de 0,6 ml en el tubo de microcentrífuga de 2 ml precortado. Selle las dos partes con Parafilm (Figura 1).
      NOTA: La parte inferior del tubo se corta para facilitar la extracción de la muestra incrustada después de que la agarosa se haya solidificado. El orificio en la tapa ayudará a mantener el tallo firme cuando el tallo esté incrustado en agarosa. El molde servirá para sujetar la agarosa y mantener el tallo recto al incrustar. El Parafilm sostendrá las dos partes, A y B, hasta que se fije la agarosa y se incruste el tallo.
   3. Con una cuchilla de afeitar, corte una sección del tallo del área de interés (por ejemplo, en el centro del primer entrenudo del tallo).
      NOTA: Lo ideal es cortar el tallo justo antes de incrustarlo para evitar su destrucción por deshidratación. Alternativamente, el tallo se puede almacenar temporalmente en una placa que contenga un papel de filtro humedecido con agua. Esta placa se puede colocar en hielo hasta que esté lista para ser incrustada para evitar la deshidratación y deformación de los tejidos. Almacenar el tallo durante períodos superiores a 30 minutos sin mucha humedad hará que el tallo se seque.
3. Derretir la agarosa en el microondas a baja intensidad.
   PRECAUCIÓN: El frasco que contiene agarosa puede estar caliente. Usa un guante para levantar la botella. Deje reposar la agarosa derretida a temperatura ambiente (entre 20 °C y 25 °C) hasta que se enfríe a unos 50 °C.
4. Pipetear lentamente 5 ml de agarosa en el molde de plástico prefabricado para llenar el vial.
   NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire en los moldes. Las burbujas de aire causarán espacios en el molde de agarosa y no cubrirán completamente la muestra del tallo, lo que eventualmente conducirá a un corte desigual de las secciones de la muestra.
   1. Deje que la agarosa se enfríe durante 30 a 60 segundos para que se vuelva semisólida. Pruebe con un palillo pequeño, asegurándose de que pueda penetrar y ponerse de pie, pero no flotar, en la agarosa.
      NOTA: Si el tallo se coloca cuando la agarosa aún está caliente, dañará la muestra al marchitar el tallo, destruyendo la morfología de la célula.
   2. Coloque el tallo en este frasco lleno de agarosa. Asegúrate de que el tallo permanezca recto. Coloque la tapa perforada de tal manera que la punta del tallo quede sujeta por la tapa. No gire el tapón de rosca. A veces, se puede incrustar más de un tallo (de un solo tipo) en un solo vial; Pero en ese caso particular, no use el cap.
      NOTA: Si se gira la tapa de rosca, el vástago se torcerá.
5. Deje el vial a temperatura ambiente o a 4 °C durante 10-30 min, hasta que se solidifique.
6. Retire el molde deslizándolo suavemente fuera del tubo. Abra el Parafilm. Empuje suavemente la parte inferior de la Parte B del molde con el pulgar para liberar la agarosa solidificada de la Parte A en un portaobjetos de microscopio de vidrio.
7. Corta el tallo incrustado en agarosa en tres piezas aproximadamente iguales de 1,2 cm de longitud. Corta la parte del tallo que no estaba en la agarosa y deséchala.
   1. Guarde estos trozos de agarosa con los tallos incrustados en tubos de microcentrífuga herméticos de 2 ml en una caja oscura a 4 °C hasta que estén listos para seccionar. Alternativamente, almacene los tubos a 4 °C durante un máximo de una semana.
      NOTA: El almacenamiento es posible, pero el experimentador debe ser consciente de que los tallos incrustados aún están vivos y, dependiendo del experimento, se podrían introducir artefactos.

>2. Sección del tallo

>PRECAUCIÓN: Lea atentamente el manual del vibratomo y siga todas las instrucciones de seguridad.

1. Asegúrese de que el disco de muestra esté limpio y completamente seco (libre de sólidos o líquidos). Limpie el disco de muestra con una cuchilla de afeitar para eliminar cualquier residuo de pegamento de experimentos anteriores y lávelo con agua. A continuación, séquelo con una toalla de papel.
   NOTA: Esto asegurará que el adhesivo funcione bien y se adhiera a la muestra de agarosa. Si este paso no se realiza correctamente, es posible que la muestra no se adhiera al disco y luego haga que la muestra se caiga del disco durante el corte.
   1. Use toallitas de papel suave para eliminar la humedad del bloque de agarosa que contiene las muestras.
   2. Coloque una pequeña gota de adhesivo para tejidos en el disco de muestra. Raye el adhesivo para cubrir el área en el centro de la placa con la punta del frasco de adhesivo. Coloque rápidamente el bloque de agarosa de modo que las muestras queden perpendiculares o paralelas a la placa para secciones transversales o longitudinales, respectivamente. Deje que el adhesivo fije la muestra al disco de muestra a temperatura ambiente o a 4 °C durante 10-30 min.
      NOTA: Este es un paso urgente.
2. Fije el disco de muestra en su lugar en la bandeja o canal de almacenamiento intermedio. Los bloques de agarosa con las secciones deben estar en paralelo con la hoja de afeitar. Llene la bandeja tampón con agua destilada a temperatura ambiente hasta que las muestras estén completamente sumergidas.
3. Corta una hoja de afeitar por la mitad y luego recorta los extremos con unas tijeras resistentes para que la hoja quede completamente plana. Coloque la mitad de la hoja de afeitar precortada en el soporte del cuchillo.
   1. Ajuste el ángulo del portacuchillas a 84°, la velocidad a 0,90 mm/seg (posición 8 en el vibrátomo) y la frecuencia a 50 Hz (posición 5 en el vibrátomo). Corte secciones de 100 μm de espesor. Utilice el modo continuo.
      NOTA: Este grosor se seleccionó para asegurar que el tejido pueda soportar los diversos tratamientos ácidos y básicos utilizados en algunos de los protocolos de tinción. Configure la ventana para seccionar y espere de 15 a 20 minutos en modo continuo para que el vibratomo seccione un bloque de agarosa de aproximadamente 1,2 cm.
4. Recoja las secciones con una pipeta de plástico desechable durante el corte en la bandeja tampón. Alternativamente, las secciones se pueden transferir de la bandeja intermedia a un vaso de precipitados de vidrio y luego a una placa de Petri transparente. Transfiera algunas secciones a los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml.
   NOTA: Los especímenes se recolectan de una placa de Petri porque es más fácil ver las secciones sobre un fondo claro y porque la bandeja tampón se puede cebar para el siguiente espécimen.
5. Las secciones pueden almacenarse en un tubo de 50 ml o recogerse y almacenarse en tubos de microcentrífuga de 1,5 a 2 ml a 4 °C durante 30 a 60 min.
   NOTA: El almacenamiento de las secciones durante períodos más largos dará como resultado una mala calidad de imagen.

>3. Tinción blanca de calcofluor

1. Disolver 0,02 g de abrillantador fluorescente 28 (calcofluor blanco M2R) en 10 ml de agua destilada para preparar una solución madre al 0,2%. La solución al 0,2% puede almacenarse durante seis meses en un frasco oscuro a 4 °C. Prepare una solución de trabajo al 0,02% diluyendo la solución madre al 0,2% 10 veces con agua destilada.
2. Transfiera las secciones del tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir al tubo 1 ml de la solución de blanco de calcofluor al 0,02%. Pipetear suavemente la solución de blanco de calcofluor al 0,02% hacia arriba y hacia abajo.
   NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta, ya que esto puede dañar las secciones.
   1. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y repetir el pipeteo. Incubar la sección durante otros 3 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: Deje que las secciones se asienten en el fondo del tubo para que sea más fácil pipetear la solución sin dañar las secciones.
   2. Utilice una pipeta de 1 ml para extraer 700 μl de solución de blanco de calcofluor al 0,02% y añada 700 μl de agua destilada; espere 5 min para enjuagar la solución de blanco de calcofluor. Repita el lavado 3-4 veces. Utilice una pipeta de 1 ml con la punta de la pipeta cortada de tal manera que las secciones se puedan pipetear fácilmente sin dañarse.
   3. Pipetee suavemente las secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio y cúbralas con un cubreobjetos. Observe las secciones bajo luz ultravioleta.

Resultados

Figura 1. Molde casero para incrustar los tallos. En el lado izquierdo; la parte superior del tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de 2 ml (parte A) y la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (parte B). En el lado derecho; el Parafilm que sostiene las dos partes; A y B para formar el molde final.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
agarosa	EMD	MERC2125	Número CAS: 9012-36-6
Abrillantador Fluorescente 28/ Calcofluor Tinte Blanco	sigma	F3543	Ácido 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxietil)amino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]amino]estilbeno-2,2'-disulfónico [Número CAS 4404-43-7]
Vibratomo	Leica	Leica Microtomo de cuchilla vibratoria VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
navaja	Empresa americana de maquinillas de afeitar de seguridad	Articulo # 60-0139-0000	Hoja de doble filo de acero inoxidable (Personna Super)
Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca (2 ml)	VWR	16466-044
Tubos de microcentrífuga (0,6 ml)	Axygen Científico	MCT-060-C
Mitt	Bel-Arte	380000000	SCIENCEWARE Guante protector de manos calientes
Adhesivo para tejidos	Ted Pella Inc	10033	Almacenar a 4 °C o 20 °C durante 3 meses o más
microonda	Panasonic	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 Adhesivo instantáneo para tejidos
Micro Cubreobjetos, Cuadrado, Nº 1	VWR	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Los cubreobjetos son resistentes a la corrosión y uniformemente gruesos y planos. El espesor n.º 1 es de 0,13 a 0,17 mm.
Micro portaobjetos esmerilados, 1 mm	VWR	48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
Parafilm M	Embalaje de Alcan	BRNDPM998