Electroforesis en gel de poliacrilamida: una técnica analítica para detectar sulfatos de heparán de diferentes longitudes de cadena aislados de tejido pulmonar de ratón

Resumen

Fuente: LaRiviere, W. B. et al., Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra el procedimiento de separación de sulfatos de heparán aislados de tejido pulmonar de ratón utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida.

Protocolo

>1. Electroforesis en gel de poliacrilamida de glicosaminoglicanos aislados y purificados

1. Prepare las soluciones necesarias para la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con anticipación (Tabla 1).
   nota: Seleccione el porcentaje de acrilamida de la solución de gel en resolución en función del tamaño de los glicosaminoglicanos que se espera que haya en la muestra. Se recomienda un 15% para resolver fragmentos más grandes (más de 30 subunidades de disacáridos de longitud); 22% para fragmentos más pequeños (<20 subunidades de disacáridos de longitud).
2. Coloque el casete vacío en el tanque PAGE. Mezcle el gel resolutivo de la siguiente manera: En un tubo de 15 mL, mezcle 10 mL de solución de gel resolutivo, 60 μL de persulfato de amonio al 10% (debe estar recién preparado) y 10 μL de TEMED (agregue TEMED al final). Invierta el tubo suavemente 2-3 veces. Utilice la pipeta para añadir rápidamente la solución de 10 ml anterior al casete. Cubra con 2 mL de agua desionizada y filtrada y deje que el gel resolutivo polimerice durante 30 min.
   nota: El siguiente protocolo PAGE se ha optimizado para un sistema PAGE vertical que utiliza casetes de fundición de 13,3 x 8,7 cm (ancho x largo) y 1,0 mm de espesor con un volumen total de aproximadamente 12 ml. Se pueden utilizar otros sistemas de casetes, pero pueden requerir optimización por parte del usuario final.
3. Después de que el gel de resolución se haya polimerizado completamente, deseche el agua superpuesta y mezcle el gel de apilamiento de la siguiente manera: en un tubo de 15 mL, mezcle 3 mL de la solución de gel de apilamiento, 90 μL de persulfato de amonio al 10% (debe estar recién preparado), 3 μL de TEMED (agregue TEMED al final).
4. Invierta el tubo suavemente 2-3 veces. Use una pipeta para agregar rápidamente la solución de gel apilante sobre el gel de resolución solidificado; Llene el casete hasta el borde. Inserte completamente el peine incluido con la configuración. Deje que el gel apilador polimerice durante 30 minutos.
5. Una vez que el gel se haya polimerizado, asegúrese de que la tira de cinta se haya retirado de la parte inferior del casete y vuelva a colocar el casete en el conjunto del tanque PAGE.
6. Llene las cámaras superior e inferior con un tampón de cámara superior e inferior, respectivamente.
7. Disuelva las muestras secas del paso 1.11.4 en el volumen mínimo necesario de agua desionizada y filtrada (como máximo, el 50% del volumen de los pocillos en el gel PAGE). Mezclar 1:1 con tampón de carga de muestras. Cargue las muestras y las "escaleras" de oligosacáridos HS (ver Tabla 1) en el gel.
8. Deje correr el gel durante 5 minutos a 100 V. A continuación, ejecute el gel a 200 V durante 20-25 min (para un gel resolutivo de poliacrilamida al 15%), 40-50 min (para un gel resolutivo de poliacrilamida al 18%), 90-100 min (para un gel resolutivo de poliacrilamida al 22%)
   nota: Puede ser necesaria una optimización del tiempo de funcionamiento de 200 V. El rojo de fenol migra antes que los oligosacáridos de heparina que tienen 2 subunidades poliméricas de longitud (es decir, grado de polimerización 2 o dp2); El azul de bromofenol migra por delante de DP10-DP14. Los mejores resultados se obtienen cuando el voltaje se aplica de tal manera que la banda de rojo fenol migra casi, pero no del todo, al fondo del gel. Ajuste el tiempo de ejecución en consecuencia.

Resultados

Tabla 1: Soluciones necesarias para la electroforesis en gel de poliacrilamida de glicosaminoglicanos purificados. Todas las soluciones deben filtrarse (0,22 μm) antes de su uso.

NOTA: Todas las soluciones deben filtrarse (0.22μm) antes de su uso.
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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Persulfato de amonio (sólido)	ThermoFisher Scientific	BP179-25	Grado de electroforesis
Sistema de purificación de agua Barnstead GenPure Pro	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	Cualquier sistema de desionización/purificación de agua es un sustituto aceptable
Ácido bórico (sólido)	ThermoFisher Scientific	A73-500	Grado de biología molecular
Azul de bromphenol (sólido)	ThermoFisher Scientific	B392-5
Criterion casete vacío para PAGE (1,0 mm de grosor, 12+2 pocillos)	Bio-Rad	3459901	Cualquier sistema de casete de fundición PAGE de 1,0 mm de grosor será suficiente
Criterio PAGE Sistema de celdas (celda y fuente de alimentación)	Bio-Rad	1656019	Cualquier sistema PAGE de gel vertical comparable funcionará)
Sal disódica EDTA (sólida)	ThermoFisher Scientific	02-002-786	Grado de biología molecular
Glicina (sólida)	ThermoFisher Scientific	G48-500	Grado de electroforesis
Ácido clorhídrico (líquido)	ThermoFisher Scientific	A466-250
N,N'-metileno-bis-acrilamida (sólido)	ThermoFisher Scientific	BP171-25	Grado de electroforesis
Rojo de fenol (sólido)	ThermoFisher Scientific	Pág. 74-10	Ácido libre
Sacarosa (sólida)	ThermoFisher Scientific	BP220-1	Grado de biología molecular
TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiamina)	ThermoFisher Scientific	BP150-20	Grado de electroforesis
Base de tris (sólida)	ThermoFisher Scientific	BP152-500	Grado de biología molecular
Unidad de filtro de vacío, de un solo uso, PES de poro de 0,22 uM, volumen de 500 ml	ThermoFisher Scientific	569-0020	Volúmenes alternativos y materiales de filtrado aceptables
Acrilamida (sólida)	ThermoFisher Scientific	BP170-100	Grado de electroforesis
Decasaccárido derivado de heparina (dp10)	Galeno científico	HO10
Hexascárido derivado de la heparina (dp6)	Galeno científico	HO06
Oligosacárido derivado de heparina (dp20)	Galeno científico	HO20