Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio para el análisis de proteínas: una técnica para separar y visualizar proteínas basada en el peso molecular

Resumen

Fuente: Sultana, S. et al. Extracción y visualización de agregados de proteínas después del tratamiento de Escherichia coli con un estresor proteotóxico. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra una técnica de separación de proteínas basada en poliacrilamida desnaturalizante. Esta técnica ayuda en la identificación preliminar de proteínas en función de sus pesos moleculares.

Protocolo

1. Separación y visualización de agregados de proteínas extraídos mediante SDS-PAGE

1. Prepara un gel de poliacrilamida SDS al 12%
   1. Para dos geles separadores, pipetear 5,1 mL de agua bidestilada (ddH₂O), 3,75 mL de Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 mL de SDS al 20% (p/v), 6 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida al 30% (29:1), 75 mL de persulfato de amonio al 10% p/v y 10 mL de tetrametiletilendiamina (TEMED) en un tubo de centrífuga de 15 mL y mezclar suavemente sin introducir burbujas de aire. Vierta el gel con una pipeta de 1 mL dentro de las placas de vidrio, dejando los 2 cm superiores libres de la mezcla. Agregue un 70% de etanol en la parte superior del gel separador y permita una interfaz uniforme entre las dos capas.
   2. Después de la polimerización del gel separador, prepare el gel de apilamiento pipeteando 1,535 mL de ddH₂O, 625 mL de Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mL de SDS al 20% (p/v), 335 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida al 30% (29:1), 12,5 mL de persulfato de amonio al 10% p/v y 2,5 mL de TEMED. Retire el etanol de los geles separadores y agregue la solución de gel apilante. Inserte un peine con el número deseado de bolsillos sin introducir burbujas de aire. Permitir la polimerización durante 20-30 min.
2. Cargue 4 μL de cada muestra y escalera de proteínas en pocillos separados y haga funcionar los geles en el tampón de funcionamiento de Tris-Glycine (Tabla 1) a 144 V durante 45 minutos a temperatura ambiente><. nota: Detenga el gel cuando la banda de bromofenol esté a punto de migrar fuera del gel.
3. Tiñir los geles en una solución Fairbanks A precalentada (Tabla 1) durante 30 minutos sobre un balancín.
4. Decolore el/los gel/es en una solución Fairbanks D precalentada (Tabla 1) hasta el fondo deseado (por ejemplo, durante la noche) en un balancín.

Resultados

Soluciones	Recetas
Búfer A	10 mM de fosfato de potasio (pH 6,5), 1 mM de EDTA
Búfer B	Tampón A que contiene un 2% de Nonidet P-40. Se puede almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior.
Fairbanks A (Solución para teñir)	25% isopropanol, 10% ácido acético glacial,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Productos químicos/reactivos
acetona	Fisher Científico	67-64-1
Solución de acrilamida/bisacrilamida al 30% 29:1	Bio-Rad	1610156
Persulfato de amonio	Millipore Sigma	A3678-100G
Bluestain 2 Escalera de proteínas, 5-245 kDa	Biografía de oro	P008-500
β-mercaptoetanol	Millipore Sigma	M6250-100ML
Azul de bromofenol	Biografía de oro	B-092-25
Coomassie Azul Brillante R-250	MP Biomedicals LLC	821616
Ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Ácido acético glacial	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Glicerol, 99%	Sigma-Aldrich	G5516-1L
glicina	Biografía de oro	G-630-1
Isopropanol (2-Propanol)	sigma	402893-2.5L
10x Búfer MOPS	Teknova	M2101
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Millipore Sigma	T9281-50ML
Base Tris	Biografía de oro	T-400-1
Material/Equipo
fuente de alimentación	ThermoFisher Scientific	EC105
rockero	Álcali Científico	RS7235
Plato de vidrio pequeño	Bio-Rad	1653311
Placas espaciadoras (1 mm)	Bio-Rad	1653308
espectrofotómetro	Termocientífico	3339053
Centrífuga de sobremesa para tubos de centrífuga de 15 mL	Beckman-Coulter
Cámara vertical de electroforesis en gel	Bio-Rad	1658004
Vórtice	Genio del vórtice de Fisher 2	12-812
Termomezclador	Benchmark Científico	H5000-HC
Peine de 10 pocillos	Bio-Rad	1653359