Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio para el análisis de proteínas: una técnica para separar y visualizar proteínas basada en el peso molecular

1. Separación y visualización de agregados de proteínas extraídos mediante SDS-PAGE

1. Prepara un gel de poliacrilamida SDS al 12%
   1. Para dos geles separadores, pipetear 5,1 mL de agua bidestilada (ddH₂O), 3,75 mL de Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 mL de SDS al 20% (p/v), 6 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida al 30% (29:1), 75 mL de persulfato de amonio al 10% p/v y 10 mL de tetrametiletilendiamina (TEMED) en un tubo de centrífuga de 15 mL y mezclar suavemente sin introducir burbujas de aire. Vierta el gel con una pipeta de 1 mL dentro de las placas de vidrio, dejando los 2 cm superiores libres de la mezcla. Agregue un 70% de etanol en la parte superior del gel separador y permita una interfaz uniforme entre las dos capas.
   2. Después de la polimerización del gel separador, prepare el gel de apilamiento pipeteando 1,535 mL de ddH₂O, 625 mL de Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mL de SDS al 20% (p/v), 335 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida al 30% (29:1), 12,5 mL de persulfato de amonio al 10% p/v y 2,5 mL de TEMED. Retire el etanol de los geles separadores y agregue la solución de gel apilante. Inserte un peine con el número deseado de bolsillos sin introducir burbujas de aire. Permitir la polimerización durante 20-30 min.
2. Cargue 4 μL de cada muestra y escalera de proteínas en pocillos separados y haga funcionar los geles en el tampón de funcionamiento de Tris-Glycine (Tabla 1) a 144 V durante 45 minutos a temperatura ambiente><. nota: Detenga el gel cuando la banda de bromofenol esté a punto de migrar fuera del gel.
3. Tiñir los geles en una solución Fairbanks A precalentada (Tabla 1) durante 30 minutos sobre un balancín.
4. Decolore el/los gel/es en una solución Fairbanks D precalentada (Tabla 1) hasta el fondo deseado (por ejemplo, durante la noche) en un balancín.

Tabla 1: Búfer, medios y soluciones. Recetas para búfer, medios y soluciones utilizadas en este protocolo.