Electroforesis en gel de poliacrilamida de urea desnaturalizante para análisis de ARN: una técnica para separar los oligonucleótidos de ARN fosforilados marcados con fluorescencia de sus equivalentes no fosforilados

Resumen

Fuente: Pillon, M. C., et al., Ensayo no radiactivo para medir la fosforilación de polinucleótidos de sustratos de nucleótidos pequeños. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos una electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante para la separación de especies de ARN fosforilado de sus contrapartes no fosforiladas. Las especies de ARN están marcadas con fluorescencia para la detección láser en el gel.

Protocolo

1. Electroforesis en gel

1. Prepare una solución de acrilamida al 15%/gel de urea 8 M.
   cautela: La acrilamida debe manipularse con cuidado, porque es una neurotoxina. Siempre use guantes, una bata de laboratorio y gafas protectoras cuando lo manipule.
   1. En un vaso de precipitados de vidrio de 150 mL, combine 22,5 mL de solución premezclada de acrilamida/bis-acrilamida al 40% 29:1, 6 mL de 10x TBE, 28,8 g de urea y agua libre de RNasa hasta obtener un volumen total de 59 mL. Revuelva suavemente la solución.
      nota: Dependiendo de la longitud del sustrato de ARN, la alteración del porcentaje de poliacrilamida puede mejorar la resolución entre el ARN no fosforilado y el fosforilado.
   2. Para disolver la urea, caliente la solución en el microondas durante 20 s, revuelva el líquido e inmediatamente vuelva a colocar la solución en el microondas durante otros 20 s. Revuelva suavemente la solución hasta que la urea se disuelva por completo.
   3. Enfríe lentamente la solución colocando el vaso de vidrio en un baño de agua poco profundo que contenga agua fría. Asegúrese de que el nivel de agua fría que rodea el vaso de vidrio esté por encima del nivel de solución dentro del vaso de precipitados de vidrio. Esto promoverá una transferencia de calor eficiente. Espere 5 min.
      nota: No continúe con este protocolo si el vaso de vidrio se siente caliente; el agua debe estar por debajo de 25 °C. Si aún se siente caliente después de 5 minutos, reemplace el agua del baño de agua con agua fría fresca y espere otros 5 minutos.
   4. Filtre y desgasifique la solución utilizando una unidad de filtración desechable de 0,22 μm para eliminar partículas y burbujas de aire microscópicas.
2. Vierte el gel desnaturalizante
   1. Utilice jabón y agua tibia para limpiar una placa de vidrio corta y larga diseñada para geles con dimensiones totales de 31,0 cm x 38,5 cm. Rocíe cada placa de vidrio con etanol al 95% y limpie el vidrio para eliminar la humedad.
      nota: Una de las dos placas se puede siliconar para evitar daños en el gel al separar el sándwich de placa de vidrio. Sin embargo, este paso no es necesario porque este protocolo está diseñado para visualizar el ARN sin separar las placas de vidrio.
   2. Coloque la placa de vidrio larga horizontalmente encima de una caja para que se eleve de la mesa de trabajo.
      cautela: La acrilamida es tóxica, por lo tanto, la estación de vertido de gel debe cubrirse con papel de banco que pueda absorber cualquier líquido derramado y colocarse inmediatamente en una bolsa de desechos una vez finalizado el procedimiento.
   3. Coloque un espaciador limpio de 0,4 mm a lo largo de los bordes largos de la placa de vidrio larga.
   4. Coloque la placa de vidrio corta encima de la placa larga y asegúrese de que los bordes de la placa corta, la placa larga y los espaciadores estén alineados. Sujete cada lado con tres abrazaderas de metal espaciadas uniformemente.
   5. Añadir 24 μL de TEMED a la solución de acrilamida al 15%/urea 8 M preparada en el paso 3.1 y mezclar la solución.
   6. Añada 600 μL de APS al 10% (p/v) a la solución en el paso 1.2.5 y mezcle suavemente la solución.
   7. Vierta inmediatamente la solución entre las placas de vidrio.
      nota: Para evitar burbujas, golpee el vaso mientras se vierte la solución.
   8. Agregue con cuidado un peine limpio de 0,4 mm y 32 pocillos en la parte superior del sándwich de placa de vidrio.
   9. Espere un mínimo de 30 minutos para que la acrilamida se polimerice.
3. Ejecuta el gel desnaturalizante
   1. Ajuste el bloque de calor a 75 °C.
   2. Retire las abrazaderas de metal que sujetan el sándwich de placa de vidrio y lave y seque bien el sándwich de placa de vidrio.
   3. Coloque el sándwich de placa de vidrio en el aparato de gel con la placa corta hacia adentro.
   4. Prepare un tampón de funcionamiento de 0,5x TBE combinando 100 mL de 10x TBE con 1,9 L de agua libre de RNasa. Agregue 600 mL del tampón de funcionamiento a las cámaras superior e inferior del aparato de gel.
   5. Retire suavemente el peine y enjuague bien los pocillos con una jeringa. NOTA: Este paso es fundamental para eliminar la urea de los pocillos.
   6. Deje funcionar previamente el gel durante 30 minutos a 50 W. El voltaje es de aproximadamente 2,000 V. PRECAUCIÓN: Este aparato de gel funciona a una potencia alta y los usuarios deben tener precaución.
   7. Enjuague bien los pocillos con una jeringa.
      nota: Este paso es crítico para la carga uniforme de la muestra en los pocillos.
   8. Pulso de giro de las reacciones apagadas. A continuación, incubar los tubos a 75 °C durante 3 min. Repite el pulso.
   9. Cargue inmediatamente 10 μL de muestra por pocillo y haga funcionar el gel durante 3 h a 50 W.
      nota: El ARN marcado con fluorescencia es sensible a la luz; Por lo tanto, cubra el aparato de gel con papel de aluminio.
4. Imagen el gel desnaturalizante.
   1. Apague la fuente de alimentación y drene la cámara superior del aparato de gel.
   2. Lave y seque el lado exterior del sándwich de plato de vidrio con agua y jabón. Cubra el sándwich de plato de vidrio con papel de aluminio mientras transporta el gel.
   3. Monte el sándwich de placa de vidrio en la platina de un escáner láser capaz de detectar fluorescencia cuantitativa y sensible.
      nota: Este gel es extremadamente fino para una máxima resolución. Por esta razón, este protocolo está diseñado para evitar las dificultades de eliminar el gel del sándwich de placa de vidrio mediante la visualización directa del ARN marcado con fluorescencia a través de las placas de vidrio. El uso de placas de vidrio de baja fluorescencia disponibles en el mercado aumentará la señal capturada al mejorar la relación señal-ruido.
   4. Ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión del escáner láser para el fluoróforo deseado.
      nota: Las longitudes de onda óptimas de excitación y emisión pueden diferir para fluoróforos específicos. Para el fluoróforo FAM, las longitudes de onda de excitación y emisión son 495 nm y 535 nm, respectivamente.
   5. Defina el área que se visualizará en la platina del escáner láser y obtenga una imagen del gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1).

Resultados

Figure 1:strong style="font-size: 13px;">Ejemplo de análisis de gel desnaturalizante de ARN fosforilado. Ensayo in vitro de ARN quinasa de Las1-Grc3 (110 nM) incubado con 500 nM de ARN SC-ITS2. X marca la reacción de control sin Las1-Grc3 y el triángulo negro representa la valoración de ATP de 0 a 10 mM. El ARN C2 es el res...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Peine de 34 pocillos de 0,4 mm	BioRad	1653848
Espaciador de 0,4 mm	BioRad	1653812
0,5 M EDTA pH 8,0	KD Medicina	RGF-3130
Cloruro de magnesio 1M	KD Medicina	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Medicina	RGF-3360
40% Acrilamida/Bis Solución 29:1	BioRad	1610146
Cloruro de sodio 5M	KD Medicina	RGF-3720
persulfato de amonio (APS)	BioRad	161-0700
ATP	sigma	A2383-1G
Ácido bórico	sigma	B0394
sal sódica azul de bromofenol	sigma	B5525-5G
Placas de vidrio	Thomas Científico	1188K51
Secuenciador Hoefer SQ3	Hoefer	N/A
Software de imagen J	N/A	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
Oligonucleótidos de ARN marcados	IDT (en inglés)	Pedido personalizado
Fuente de alimentación Pharmacia EPS 3500	Farmacia	N/A
Filtro Steriflip 0. 22 mmm	Millipore	5FCP00525
TEMED	BioRad	161-0800
Base Tris	sigma	TRIS-RO
Generador de imágenes en gel Typhoon FLA 9500	GE Cuidado de la Salud	N/A
Agua DEPC ultra pura	Invitrogen	750023
Glicerol ultra puro	Invitrogen	19E1056865
urea	Fisher Chemical	U15-500