Electroforesis bidimensional semidesnaturalizante en gel de agarosa: una técnica para separar fibras de amiloide polimórficas en función de la heterogeneidad de tamaño

Resumen

Fuente: Hanna-Addams, S., et al. Uso de electroforesis bidimensional semidesnaturalizante en gel de agarosa para confirmar la heterogeneidad del tamaño de las fibras amiloides o similares a las amiloides. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra la separación bidimensional de fibras amiloides basada en electroforesis con gel de agarosa y detergente semidesnaturalizante. La técnica separa los agregados polimórficos de amiloide en función de su tamaño heterogéneo.

Protocolo

1. Preparar muestras

1. Cultivo de 2 x 10⁶ células de cáncer de colon HT-29 productoras de amiloide en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm en 10 mL de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% de suero fetal bovino y penicilina-estreptomicina. Cultivar células durante la noche en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂.
   1. Después de que las células crezcan hasta el 80% de confluencia, lávelas con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 3 mL de solución de tripsina e incubar a 37 °C durante 3 min.
   2. Después de que las células estén totalmente disociadas de la placa, agregue 10 mL de medio de cultivo y transfiera las células con una pipeta de 10 mL a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Aspire el medio, vuelva a suspender las células en 5 ml de medio de cultivo y cuente las células con un contador de células. Plato 2 x 10⁶ celdas en cada uno de los dos platos de 10 cm.
   3. Deje que las células se adhieran y se recuperen durante la noche en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂. Aplique el tratamiento a una placa para inducir la formación de amiloides con 20 ng/mL de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), 100 nM de Smac-mimético y 20 μM de inhibidor de pancaspasas Z-VAD-FMK. La combinación se abrevia como TSZ. Trate el otro plato con vehículo como control.
2. Después del período de tiempo adecuado, generalmente 6 h, coseche el lisado celular.
   1. Raspe las células de la placa con un raspador de plástico y use una pipeta de 10 ml para transferirlas a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min a 4 °C.
   2. Lavar las células 2 veces resuspendiendo en 10 mL de PBS helado y centrifugando a 1.000 x g durante 3 min a 4 °C. Aspirar la solución de PBS.
      nota: El proceso se puede pausar aquí congelando el pellet de la celda en nitrógeno líquido y almacenándolo a ˗80 °C durante un máximo de 1 mes.
   3. Transfiera el pellet de la célula a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incube en 0,3 mL de tampón de lisis durante 30 min en hielo. Centrifugar a 20.000 x g durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante es el lisado de toda la célula.
      nota: En este caso, el proceso puede detenerse almacenando la muestra a -20 °C durante varios meses.
   4. Mida la concentración de proteínas mediante un ensayo de Bradford. Agregue 4 tampones de carga SDD-AGE para preparar 20 μL de muestra de 3 μg/μL e incube a temperatura ambiente durante 10 min.

>2. Preparar y ejecutar geles

1. Añadir 2 g de agarosa a 200 ml de 1x tampón de trisacetato (TAE) en un vaso de precipitados de vidrio y calentar en el microondas para derretir la agarosa. Agregue 1 mL de SDS al 20% para una concentración final de SDS del 0.1%. Revuelva con cuidado para mezclar. Tenga cuidado de no generar burbujas después de la adición de SDS.
2. Vierta la solución de agarosa en una losa de gel de 15 cm x 14 cm. Utilice una pipeta de 1 ml para eliminar las burbujas. Coloque un peine de 20 pocillos en la parte superior.
3. Primera dimensión: Pipeta de 60 μg de lisado de células enteras en el carril de la extrema derecha. Ejecute el gel a 60 V durante aproximadamente 4 h (hasta que el frente del tinte esté aproximadamente 3/4 a través del gel) utilizando el TAE que contiene 0.1% SDS como tampón de funcionamiento.
4. Segunda dimensión: Gire con cuidado el gel 90° en sentido contrario a las agujas del reloj (Figura 1A). Haga funcionar el gel a 60 V durante aproximadamente 4 h.
   nota: La condición general de funcionamiento es de 4 V/cm de longitud de gel. Es importante que las condiciones de funcionamiento sean exactamente las mismas para la primera y la segunda dimensión.

Resultados

Figura 1. Protocolo experimental.(A) Esquema de la electroforesis bidimensional semidesnaturalizante en gel de agarosa (2D SDD-AGE). Comience cargando la muestra en el carril más a la derecha, etiquetado en rojo. Después de la finalización de la primera ejecución de dimensión, gire el gel 90° en sentido contrario a las agujas del reloj. Ejecute la electroforesis de segunda dimensión. La flecha continua...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Unidad de electroforesis en gel	pescador	HE99XPRO	Appratus para correr en gel.
Agrose	VWR	97062-250	Para gel de agarosa.
DMEM	sigma	D6429	para cultivo celular
suero fetal bovino	sigma	F4135	para cultivo celular
penicilina-estreptomicina	sigma	P4333	para cultivo celular
Solución de tripsina	sigma	T4049	para cultivo celular
PBS para el cultivo de tejidos	sigma	D8662	para cultivo celular
TNF recombinante	Hecho en nuestro laboratorio		para inducir la necroptosis. Véase la referencia 11.
smac-mimético	regalo del Dr. Xiaodong Wang		para inducir la necroptosis. Véase la referencia 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	para inducir la necroptosis. Véase la referencia 11.
Contador de células	Bio-Rad	1450102	Modelo TC20; para el recuento de células
Kit de ensayo de proteínas Pierce™ BCA	Termo Científico	23225	para medir la concentración de proteínas en lisados celulares
Elevador de células	pescador	07-200-364	Para eliminar las células del plato
Tampón de lisis (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL de glicerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (inhibidores de proteasas y fosfatos según se desee)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11,42 mL de ácido acético glacial 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 a 1 L
4X Tampón de carga SDD-AGE (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL de glicerol 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% azul de bromofenol 31 mL ddH2O
Tampón de lavado PBST (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 añadir ddH2O a 10 L