Multimer-PAGE para separar complejos de proteínas nativas: una técnica de separación híbrida que consiste en Blue Native-PAGE y SDS-PAGE para separar proteínas multiméricas intactas del lisado de tejidos.

Abstract

Fuente: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: Un método para capturar y resolver complejos de proteínas en muestras biológicas. J. Vis. Exp. (2017).

Este video describe PAGE multimérico para separar complejos de proteínas nativas de homogeneizados de tejidos. La técnica es un híbrido de las técnicas blue native-PAGE y SDS-PAGE. Los complejos separados pueden caracterizarse y estudiarse por su papel en el funcionamiento celular.

Protocol

>1. Preparación de tejidos

1. Prepare 10 mL de tampón de muestra 4x BN-PAGE (200 mM Bis(2-hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)metano (Bis-Tris), 200 mM de NaCl, 40% p/v glicerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2).
   nota: Esta solución madre puede prepararse con antelación y almacenarse a 4 °C.
2. Diluir 250 μL de tampón de muestra 4x en 750 μL dH₂O que contiene 1x cóctel comercial de inhibidores de proteasa. Vórtice y enfriamiento en el hielo.
3. Homogeneizar 20 mg de tejido diana en el tampón de muestra BN-PAGE 1 mL 1x helado con 30 pasadas de un homogeneizador de onzas limpias.
   nota: Para este experimento de demostración, el tejido objetivo es tejido cerebral de rata completo. Después de la homogeneización, las muestras pueden tratarse con un detergente suave, como digitonina al 2%, para solubilizar y permitir la electroforesis de las proteínas de membrana.
4. Transfiera el homogeneizado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugue a 14.000 x g durante 30 min para pellet el contenido celular insoluble. Después de la centrifugación, decantar el sobrenadante en un tubo limpio sobre hielo.
5. Siga las instrucciones del fabricante para medir la concentración de proteínas sobrenadantes utilizando ácido bicinconínico (BCA) o un ensayo de cuantificación de proteínas similar.
6. Si la(s) muestra(s) homogeneizada(s) contienen(s) detergente, añadir una cantidad de Azul de Coomassie G-250 al 5% en una solución acuosa suficiente para llevar la solución homogeneizada al 0,25% de Coomassie.

2. BN-PÁGINA

1. Diluya 25 mL 20x de tampón de electroforesis nativo azul (BN) (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricina, pH 6,8) en 475 mL dH₂O que contengan 0,002% de Azul de Coomassie para hacer 500 mL de 1x tampón de funcionamiento.
   1. Si las muestras contienen detergente, en su lugar prepare 250 mL de 1x tampón de funcionamiento que contenga 0.02% de Coomassie y otros 250 mL que no contengan nada.
2. Enfríe los tampones a 4 °C.
3. Limpie y ensamble un casete de vertido de gel de poliacrilamida de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Vierta el gel de poliacrilamida BN (3% de capa de apilamiento de T, 6% de capa de resolución de T) de acuerdo con una receta estándar y coloque el peine de pocillos.
5. Después de que los geles se hayan polimerizado, enjuague el casete con dH₂O y ensamble el aparato de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Retire el peine de pocillos y llene los pocillos con 1x tampón de funcionamiento BN-PAGE. Evite llenar toda la cámara interior con tampón hasta que se carguen las muestras.
   1. Si las muestras contienen detergente, llene los pocillos con el tampón que contiene 0.02% Coomassie Blue.
      NOTA: Realice los pasos 2.7-2.9 a 4 °C.
7. Con las puntas de carga de gel, pipetee un volumen de homogeneizado que contenga 20 μg de proteína en los pocillos deseados. Pipetear un volumen equivalente de 1x tampón de muestra BN-PAGE en cualquier pocillo no utilizado.
   nota: Utilice la concentración de proteína determinada a partir del ensayo BCA para calcular el volumen adecuado del homogeneizado que se añadirá a los pocillos.
8. Una vez cargadas las muestras, llene la cámara interior con 1x búfer de ejecución BN-PAGE. Asegúrese de que el gel esté completamente sumergido en el tampón. A continuación, llene la cámara exterior con 1x tampón de funcionamiento hasta el nivel indicado por el fabricante.
   1. Si las muestras contienen detergente, llene la cámara interior con el tampón 1x que contiene 0,02% de Coomassie Blue y la cámara exterior con tampón de funcionamiento 1x sin colorantes.
9. Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y electroforese las proteínas en el gel a 150 V hasta que la banda de tinte progrese ~ 2 cm en la capa de resolución. Detenga y desconecte la fuente de alimentación.

>3. Reticulación

NOTA: Realice los pasos 3.1-3.6 a 4 °C.

1. Desmonte el aparato de electroforesis y separe los cristales del casete de gel. Retire y deseche la capa de apilamiento.
2. Corta con cuidado el gel justo debajo del borde inferior del frente del tinte. Tenga cuidado de hacer este corte lo más suave y recto posible, y luego deseche el trozo de gel sin usar. Esto dejará una tira horizontal de gel de poliacrilamida de ~2 cm de ancho, que contendrá toda la proteína de la muestra homogeneizada.
3. Recorta las partes no utilizadas a lo largo de los bordes de la tira de gel.
4. Coloque con cuidado la tira en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un recipiente pequeño y mezcle suavemente por nutación durante 30 minutos para equilibrar.
5. Después del equilibrio, deseche y reemplace el PBS con otros 10 mL. Pipetear 500 μL de 25 mM de DSP disuelto en dimetilsulfóxido en el PBS, y continuar mezclando como se indica arriba (paso 3.4) durante 30 min.
6. Vierta la solución DSP. Agregue 10 mL de clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl) de 0,375 M, pH 8,8, que contenga un 2% de dodecil sulfato de sodio (SDS) para apagar el DSP no reaccionado. Continúe la nutación durante 15 min.

>4. SDS-PAGE

1. Mientras la tira de gel se enfría, prepare las soluciones de gel SDS-PAGE de acuerdo con los métodos estándar. No agregue reactivos de polimerización.
2. Después del enfriamiento, vuelva a colocar la tira de gel ΒΝ a temperatura ambiente y colóquela en un nuevo casete de gel.
   1. Para hacer esto, recoja con cuidado el gel y colóquelo sobre una placa espaciadora de casete de gel limpia.
   2. Oriente la tira de modo que la parte inferior del frente del tinte esté más cerca de la parte superior de un casete nuevo (es decir, el lado que viajó más lejos durante BN-PAGE debe estar más cerca de la parte superior del casete nuevo; la tira de gel debe voltearse de su orientación anterior). Véase la figura 1.
   3. Coloque la tira de manera que su borde superior quede a la altura de donde estará el borde superior de la placa de cubierta (es decir, estará en la parte superior del nuevo gel). Asegúrese de que el frente del tinte esté paralelo a los bordes horizontales de la placa de vidrio.
   4. Empuje un lado de la tira extirpada contra una de las paredes del espaciador, dejando espacio en el otro lado para verter el gel y cargar un patrón de proteínas o una escalera.
   5. Si el borde inferior de la tira de gel contiene áreas irregulares o irregulares, córtelas con cuidado. Si están presentes, atraparán las burbujas durante el vertido del gel.
   6. Una vez que la tira de gel esté colocada correctamente, coloque la placa de cubierta sobre la placa espaciadora. Aplique una presión suave para expulsar las burbujas de aire atrapadas.
   7. Continúe ensamblando el aparato de vertido de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Añada reactivos de polimerización al tampón de gel resolutivo y viértalo en el casete de gel preparado, utilizando una pipeta serológica. Llene el casete de gel hasta ~2 cm por debajo de la tira de gel BN-PAGE extirpada, para dejar espacio para la capa de apilamiento.
4. Agregue 100 μL de butanol sobre la parte superior del gel vertido y espere 30 minutos para la polimerización de la capa de resolución. Vierte el butanol.
5. Agregue reactivos de polimerización a la solución de gel de apilamiento. Con una pipeta serológica, vierta la capa de apilamiento para llenar todo el espacio vacío restante en el casete de gel.
   1. Incline el casete de gel a medida que se vierte la capa de apilamiento para que llene el espacio debajo de la tira de gel y las burbujas de aire no queden atrapadas.
   2. A medida que el tampón de gel apilable llena el espacio vacío debajo de la tira de gel, regrese gradualmente el casete de gel a una base nivelada.
   3. Continúe llenando el espacio vacío junto a la tira de gel extirpada con el tampón de gel apilable, hasta que casi se desborde.
6. Deje que la capa de apilamiento polimerice durante 30 min.
   nota: Produzca 10 tampones de funcionamiento SDS-PAGE (250 mM de tris(hidroximetil)aminometano (tris), 1,9 M de glicina, 1% de SDS) mientras el gel se polimeriza. Esto también se puede hacer de antemano y almacenar a temperatura ambiente.
7. Diluya 50 mL 10x SDS-PAGE en 450 mL dH₂O para hacer 1x tampón de trabajo.
8. Después de que la capa de apilamiento se haya polimerizado, retire el casete de gel del aparato de vertido, enjuague con dH₂O y ensamble el aparato de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
9. Llene completamente la cámara interior con 1x tampón de ejecución SDS-PAGE, luego llene la cámara exterior hasta el nivel indicado por el fabricante.
10. Cargue el espacio junto a la tira de gel extirpada con una escala de peso molecular o un estándar de proteína adecuado.
11. Conecte los electrodos a la fuente de alimentación y electroforese las muestras a 120 V. Cuando el tinte Coomassie se escurra por el gel, detenga y desconecte la fuente de alimentación.
12. Analice el gel utilizando métodos estándar de electrotransferencia y detección de proteínas mediante la unión de anticuerpos.

Results

Figura 1: Diagrama de flujo general de multimer-PAGE.
(A) Preparar el lisado de tejidos utilizando métodos no desnaturalizantes, como la homogeneización en tampón de muestra BN-PAGE. (B) Pipetear el lisado en gel BN-PAGE, luego realizar la electroforesis (150 voltios) en el tampón de funcionamiento BN-PAGE. Deje que la muestra migre hasta que el frente del tinte haya migrado ~ 2 cm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
productos químicos
Ácido ε-aminocaproico	sigma	A2504
acrilamida	Acros Organics	164855000	nocivo.
Acrilamida/bisacrilamida 37,5:1 (solución madre al 40 % T)	BioRad	161-0148	nocivo.
Persulfato de amonio	sigma	A3678
Anti conejo IgG-HRP de cabra	Biotecnología de Santa Cruz	SC-2004
Kit de ensayo de ácido bicinconínico	Termopescador	23225
Bis-tris	sigma	B9754
Albúmina sérica bovina	sigma	A9647
butanol	Fisher Científico	A399-1
Kit de sustrato de quimioluminiscencia	ThermoFisher	24078
Coomassie azul G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	sigma	D141	nocivo.
Dimetilsulfóxido	Fisher Científico	D128-1
Dithiobis(succinimidilpropionato)	Termo Científico	22585
Leche descremada en polvo	LabScientific	M0841
glicerol	sigma	G9012
glicina	Fisher Científico	BP381-5
Cóctel de inhibidores de la proteasa Halt	Termopescador	78430
ácido clorhídrico	Fisher Científico	A144SI-212	Para la valoración. Cáustico.
metanol	Fisher Científico	A412-4	Para la activación de membranas de PVDF. Nocivo.
Anti α-sinucleína monoclonal IgG de conejo	Biotecnología de Santa Cruz	SC-7011-R
N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina	sigma	T9281
N,N'-metilenebisacrilamida	Acros Organics	Año 16479	nocivo.
NP40	Bioproductos de Boston	P-872
Polisorbato 20 (tween-20)	Fisher Científico	BP337-500
Membranas de transferencia de fluoruro de polivinilideno	Termo Científico	88518
Ponceau S	sigma	P3504
Cloruro de potasio	Fisher Científico	P217-3
Fosfato de potasio monobásico	sigma	P9791
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Termo Científico	88265
Solución SDS (10% p/v)	BioRad	161-0416
cloruro de sodio	Fisher Científico	BP358-212
Dodecil sulfato de sodio	sigma	L37771
Fosfato de sodio monobásico	Fisher Científico	BP329-1
Tricina	sigma	T0377
Base Tris	Fisher Científico	BP152-500
Tris-HCl (tampón 0,5 M, pH 6,8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (tampón 1,5 M, pH 8,8)	BioRad	161-0798
Instrumentos
GE Imagequant LAS 4000	GE Cuidado de la Salud	28-9558-10
Software ImageJ NIH
Lector de microplacas Synergy H1	BioTek
Formador de gel + soporte	Biorad
Centrífuga Microfuge 22R	Beckman Coulter
Homogeneizador de onzas de 2 mL
Mezclador de vórtice	Fisher Científico
Homogeneizador ultrasónico de tejidos	Fisher Científico	FB120220