Electroforesis en gel de agarosa de amplicones de ADN después de la PCR: un método para analizar los productos de la PCR multiplex y evaluar el éxito de la reacción de PCR

Resumen

Fuente: Gulla, S. et al. Análisis de repetición en tándem de número variable multilocus de la bacteria patógena de peces Yersinia ruckeri mediante PCR multiplex y electroforesis capilar. J. Vis. Exp. (2019)

En este vídeo, demostramos la separación de ADN bacteriano amplificado por PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. El gel de agarosa funciona como un tamiz molecular, lo que permite que el ADN cargado negativamente migre en función de su tamaño bajo un campo eléctrico aplicado.

Protocolo

1. Confirmación de amplicón de PCR por electroforesis en gel

1. De acuerdo con las recomendaciones del fabricante, prepare un volumen de gel de agarosa al 1,5% (p/v) en 1x tampón de tris-borato-EDTA (TBE) adecuado para el número de reacciones de PCR que se van a probar. Antes de la fundición, agregue 5 μL de colorante de ácido nucleico fluorescente por 50 μL de solución de gel y mezcle. Use bandejas y peines según corresponda para la fundición, dejando un número apropiado de pocillos libres para las escaleras de referencia de ADN.
2. Después de la fijación, sumerja el gel en 1x TBE-buffer en un sistema GE. Mezcle 5 μL de producto de PCR junto con 2 μL de colorante de carga y transfiéralo a pocillos de gel. Agregue 5 μL de escalera de ADN en pozos vacíos como referencia.
3. Deje correr el gel a 110 V por 15 cm durante aproximadamente 1 h y utilice un sistema de visualización/imágenes de gel basado en UV para verificar la presencia de múltiples bandas (hasta cinco) que representan amplicones de PCR (ver ejemplo en la Figura 1). Desecha el gel. Almacene los productos de PCR restantes a 4 °C hasta su posterior procesamiento.

Resultados

Figura 1: Electroforesis en gel verificando la presencia de múltiples productos de PCR. La imagen confirma la presencia de múltiples amplicones de PCR en los 12 carriles que contienen muestras, y el primer carril representa la escalera de ADN utilizada. Se han indicado los tamaños de los fragmentos de escalera seleccionados, así como el ensayo de PCR y la afiliación de cepa de cada carril.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa, universal, peqGOLD	VWR	732-2789P/732-2788
Tampón Tris-borato-EDTA (TBE)	Na	Na	Receta estándar; producción propia.
Tinte de carga de gel de ADN (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611
Sistema de electroforesis en gel	Como se prefiera	Na
Tinción de ácido nucleico GelRed, 10,000X en agua	Biotio	41003	Colorante fluorescente de ácido nucleico
Escalera de ADN GeneRuler 50 bp, lista para usar	Thermo Fisher Scientific	SM0373	Escalera de ADN
Sistema de imagen/visualización en gel basado en UV	Como se prefiera	Na