Electroforesis capilar: una técnica para analizar amplicones de reacción en cadena de la polimerasa marcados con fluorescencia

Resumen

Fuente: Gulla, S. et al., Análisis de repetición en tándem de número variable multi-locus de la bacteria patógena de peces Yersinia ruckeri mediante PCR múltiplex y electroforesis capilar. J. Vis. Exp. (2019)

Este video describe la técnica de electroforesis capilar para analizar amplicones de PCR marcados con fluorescencia obtenidos de varias muestras en función de su tamaño. Genera un patrón migratorio que determina las longitudes de los pares de bases de los fragmentos con la ayuda del tinte fluorescente marcado en cada fragmento.

Protocolo

>1. Configuración de la electroforesis capilar y condiciones de funcionamiento

1. Después de la confirmación de los amplicones de PCR, diluya los productos de PCR 1:10 (v/v) en agua purificada. Sellar, mezclar y centrifugar brevemente.
2. Trabajando en una vitrina de gases, prepare un volumen de mezcla maestra que consista en 9 μL de formamida y 0,5 μL de tamaño estándar por producto PCR (permita un 10% de volumen excedente). Agite brevemente y distribuya 9,5 μL en pocillos en una placa adecuada para el sistema CE disponible antes de añadir 0,5 μL de producto PCR diluido. Sellar, mezclar y centrifugar brevemente.
   PRECAUCIÓN: Manéjelo con cuidado. La mezcla de formamida con agua genera ácido fórmico, que es tóxico.
3. Utilizando un termociclador de PCR, desnaturalice las muestras a 95 °C durante 3 minutos antes de enfriar a 4 °C indefinidamente. Centrifugar brevemente y cargar la placa en un sistema CE calibrado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Realice el análisis de fragmentos CE utilizando reactivos según corresponda para el aparato de elección y los siguientes ajustes: 60 °C; inyecciones de 5 s a 1,6 kV (32 V por cm); tiempo de ejecución de 32 min a 15 kV (300 V por cm). El análisis de fragmentos CE de 24 pocillos en un capilar de 24 (50 cm) normalmente tomará aproximadamente 50 min.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Analizador genético Avant 3500xL	Thermo Fisher Scientific	A30469	Se utiliza para el análisis de fragmentos de electroforesis capilar.
Tinción de ácido nucleico GelRed, 10,000X en agua	Biotio	41003	Colorante fluorescente de ácido nucleico utilizado durante la electroforesis en gel.
Software GeneMapper 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Se utiliza para leer electroferogramas de electroforesis capilar.
GeneScan 600 LIZ Tamaño de tinte estándar v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Tamaño estándar utilizado durante la electroforesis capilar.
Formamida Hi-Di	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Formamida desionizada utilizada durante la electroforesis capilar. Prepare los aliquouts de trabajo.
Agua Milli-Q	Na	Na	Agua purificada utilizada durante PCR y electroforesis capilar. Receta estándar; Producción propia.
Polímero POP-7 para analizadores genéticos 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Matriz de separación utilizada durante la electroforesis capilar.
Sistema de imagen/visualización en gel basado en UV	como se prefiera.	Na
Vórtice	como se prefiera.	Na