Electroforesis en gel alcalino de una sola célula: una técnica sensible para la estimación cuantitativa del daño en el ADN en células cancerosas individuales después de la quimioterapia

Resumen

Fuente: Lu, Y., et al. Evaluación del daño en el ADN in vitro mediante el ensayo de cometas J. Vis. Exp. (2017)

En este video, demostramos un ensayo de electroforesis alcalina de una sola célula para cuantificar roturas de ADN de cadena simple y doble en células tratadas con doxorrubicina. Las condiciones alcalinas interrumpen los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases de ADN, lo que resulta en el desenrollado completo y la separación de las hebras de ADN. Esto permite la migración diferencial de fragmentos de ADN dañados y no dañados en gel de agarosa tras la electroforesis, revelando una estructura en forma de cometa de ADN no dañado que migra lentamente formando la cabeza circular del cometa, y que migra rápidamente fragmentos de ADN dañados que forman la cola alargada del cometa.

Protocolo

1. Preparar reactivos

1. 1x PBS
   1. Diluya 100 mL 10x PBS con 900 mL dH₂O y ajuste el pH a 7,4 con un medidor de pH. Almacene a temperatura ambiente.
2. Solución de lisis (LS)
   1. Prepare 2,5 m de NaCl, 100 mM de EDTA disódico, 10 mM de base Tris y 200 mM de NaOH en 900 mL dH₂O; por lo general, se necesitan unos 20 minutos para permitir que la mezcla se disuelva por completo. Ajusta el pH a 10 con un medidor de pH. Añadir un 1% de lauril sarcosinato de sodio y un 1% de Triton X-100 y ajustar el volumen final a 1.000 mL. Deje enfriar a 4 °C durante al ....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x PBS (Ca++, Mg++ libre)	TEKnova	P0196
NaCl	sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Base de Trizma	sigma	T1503
NaOH	sigma	72068
Lauril sarcosinato de sodio	sigma	L7414
Tritón X-100	sigma	93443
SYBR Verde	Invitrogen	S33102
Agarosa de bajo punto de fusión	Invitrogen	16520
agarosa	Invitrogen	16500
95% de etanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
tripsina	GIBCO	25300-054
Portaobjetos de tejido de vidrio	CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA	63422-11
Toallitas Kimwipes	KIMberly-Clark
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	DENVILLE
Puntas de pipeta	afilado
microonda	Avanti
Baño de agua	precisión
Cámara de electroforesis horizontal	TREVIGEN	Cometassay ES II
fuente de alimentación	Bio-Rad
incubadora	Laboratorio de Quincy	Modelo 12-140E
Microscopio fluorescente	Zeiss	LSM700
Micropipeta	Eppendorf