Electroforesis en gel alcalino de una sola célula: una técnica sensible para la estimación cuantitativa del daño en el ADN en células cancerosas individuales después de la quimioterapia

Resumen

Fuente: Lu, Y., et al. Evaluación del daño en el ADN in vitro mediante el ensayo de cometas J. Vis. Exp. (2017)

En este video, demostramos un ensayo de electroforesis alcalina de una sola célula para cuantificar roturas de ADN de cadena simple y doble en células tratadas con doxorrubicina. Las condiciones alcalinas interrumpen los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases de ADN, lo que resulta en el desenrollado completo y la separación de las hebras de ADN. Esto permite la migración diferencial de fragmentos de ADN dañados y no dañados en gel de agarosa tras la electroforesis, revelando una estructura en forma de cometa de ADN no dañado que migra lentamente formando la cabeza circular del cometa, y que migra rápidamente fragmentos de ADN dañados que forman la cola alargada del cometa.

Protocolo

1. Preparar reactivos

1. 1x PBS
   1. Diluya 100 mL 10x PBS con 900 mL dH₂O y ajuste el pH a 7,4 con un medidor de pH. Almacene a temperatura ambiente.
2. Solución de lisis (LS)
   1. Prepare 2,5 m de NaCl, 100 mM de EDTA disódico, 10 mM de base Tris y 200 mM de NaOH en 900 mL dH₂O; por lo general, se necesitan unos 20 minutos para permitir que la mezcla se disuelva por completo. Ajusta el pH a 10 con un medidor de pH. Añadir un 1% de lauril sarcosinato de sodio y un 1% de Triton X-100 y ajustar el volumen final a 1.000 mL. Deje enfriar a 4 °C durante al menos 30 minutos antes de usar.
3. Solución de electroforesis alcalina (AES), pH >13
   1. Prepare 200 mM de NaOH y 1 mM de EDTA disódico en 800 mL dH₂O. Ajuste el pH y asegúrese de que tenga un pH >13. Ajuste el volumen final a 1.000 mL. Refrigerar antes de usar y enfriar a 4 °C durante al menos 30 minutos antes de usar
4. Solución de tinción
   1. 1. Añada 1 μL de tinción de ácido nucleico fluorescente verde 10.000x (por ejemplo, SYBR Green) en 30 mL de tampón Tris-EDTA (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA disódico, pH 7,4) y almacene a 4 °C. Proteger de la luz.
5. 1% de agarosa de bajo punto de fusión
   1. Derretir 1% de agarosa de bajo punto de fusión (1 g en 100 mL dH₂O) en un microondas. Agite la agarosa cada 15-20 segundos para asegurarse de que la agarosa esté completamente fundida. Coloque la agarosa en un baño de agua a 37 °C durante al menos 20 minutos antes de usar.
6. Puntas de pipeta precalentadas
   1. Corte los extremos estrechos de las puntas de pipeta P200 3 mm y caliéntelos a 37 °C antes de pipetear la agarosa.

2. Preparar Diapositivas de Cometas

1. Recubrimiento deslizante
   1. Derretir agarosa al 1% (1 g en 100 mL dH₂O) en el microondas durante 2 - 3 min o hasta que la agarosa esté completamente fundida. Sumerja los portaobjetos de vidrio del microscopio en la agarosa y limpie un lado del portaobjetos con una toallita sin pelusa.
   2. Coloque los portaobjetos sobre una superficie plana para que se sequen al aire o caliéntelos a 50 ° C para un secado más rápido; se debe formar una película de agarosa transparente después del secado. Coloque los portaobjetos recubiertos a 37 °C antes de usar.
2. Preparación de suspensiones unicelulares
   1. Cultivo y tratamiento de la célula del glioma
      1. Cultivo de las células U251 MG en medio DMEM-Ham F-12 suplementado con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 10 μg/mL de estreptomicina a 37°C con 5% de CO₂.
      2. Digiera las células usando 1 mL de tripsina durante 3 min y neutralice la tripsina usando el medio DMEM-Ham F-12 con FBS. Recoja en un tubo de 15 mL, centrifugue a 300 x g durante 4 min, aspire el medio y suspenda las celdas a 2 x 10⁵ celdas/mL en 1x PBS.
         nota: La muestra de células debe prepararse inmediatamente antes de comenzar el ensayo y todas las muestras deben manipularse en un entorno oscuro o atenuado para evitar daños en el ADN causados por la luz.
      3. Combine la suspensión celular con un 1% de agarosa fundida de bajo punto de fusión (a 37 °C) en una proporción de 1:10 (v/v), mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, e inmediatamente pipetee 30 μL en un portaobjetos recubierto de agarosa. Utilice el lateral de la punta de la pipeta para esparcir la mezcla de agarosa/célula y asegurar la formación de una capa fina.
      4. Coloque el portaobjetos plano a 4 °C en la oscuridad durante 10 min. Aumentar el tiempo de gelificación a 30 min mejora la adherencia de las muestras en ambientes de alta humedad.
      5. Sumerja el portaobjetos a 4 °C LS en la oscuridad durante 1 h hasta toda la noche.
3. Electroforesis de célula única
   1. Para el ensayo de cometas alcalinos
      1. Retire suavemente los portaobjetos del LS, drene el exceso de tampón y sumérjalo suavemente en AES durante 1 h a 4 °C para permitir el desenrollado del ADN. Mantén las diapositivas en la oscuridad.
      2. Agregue AES preenfriado en la bandeja de portaobjetos de electroforesis, no exceda los 0,5 cm por encima de los portaobjetos (esto depende del tamaño de las unidades de electroforesis), coloque los portaobjetos dentro y cúbralos con una tapa. Ajuste el voltaje de la fuente de alimentación a 1 V/cm (la longitud entre electrodos) y haga funcionar durante 30 minutos a 4 °C.
      3. Drene el exceso de solución de electroforesis del portaobjetos. Sumerja suavemente los portaobjetos dos veces en dH₂O durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente.
      4. Sumerja suavemente los portaobjetos en etanol al 70% durante 5 minutos a temperatura ambiente. Proceda a la tinción.
4. Correderas Stain Comet
   1. Se seca a 37 °C durante 10 - 15 minutos en la oscuridad.
   2. Coloque 50 - 100 μL de solución de tinción de ácido nucleico fluorescente verde en cada agarosa seca y tiña durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
   3. Enjuague los portaobjetos brevemente en dH₂O y séquelos completamente a 37 °C en la oscuridad. Proceda a la adquisición y análisis de imágenes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x PBS (Ca++, Mg++ libre)	TEKnova	P0196
NaCl	sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Base de Trizma	sigma	T1503
NaOH	sigma	72068
Lauril sarcosinato de sodio	sigma	L7414
Tritón X-100	sigma	93443
SYBR Verde	Invitrogen	S33102
Agarosa de bajo punto de fusión	Invitrogen	16520
agarosa	Invitrogen	16500
95% de etanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
tripsina	GIBCO	25300-054
Portaobjetos de tejido de vidrio	CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA	63422-11
Toallitas Kimwipes	KIMberly-Clark
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	DENVILLE
Puntas de pipeta	afilado
microonda	Avanti
Baño de agua	precisión
Cámara de electroforesis horizontal	TREVIGEN	Cometassay ES II
fuente de alimentación	Bio-Rad
incubadora	Laboratorio de Quincy	Modelo 12-140E
Microscopio fluorescente	Zeiss	LSM700
Micropipeta	Eppendorf