Electroforesis capilar microfluídica para el dimensionamiento de fragmentos de productos de PCR: una técnica de separación electroforética basada en microchips para separar fragmentos de ADN en función del tamaño

Resumen

Fuente: Wang, H., Zhu et al. Un ensayo robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótidos de citosina-guanina-guanina en el gen del retraso mental del cromosoma X frágil-1. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la técnica de electroforesis capilar microfluídica para separar amplicones de PCR en función de su tamaño. Esta técnica ayuda en el dimensionamiento de fragmentos utilizando tintes fluorescentes y marcadores de tamaño molecular estándar.

Protocolo

1. Dimensionamiento de fragmentos de productos PCR

1. Antes de comenzar, deje que el concentrado de tinte de ADN, la matriz de gel de ADN, el marcador de ADN, la escalera de ADN y las muestras de ADN purificadas se equilibren a temperatura ambiente durante 30 minutos.
2. Configurar la estación de cebado
   1. Reemplace la jeringa (consulte la Tabla de materiales) cuando utilice un nuevo lote de reactivos.
   2. Ajuste la placa base, suelte la palanca del clip de la jeringa y deslícela hasta la posición superior.
3. Inicie el software de dimensionamiento (consulte la Tabla de materiales) y prepare la mezcla de gel y tinte.
4. Concentrado de tinte Vortex durante 10 s y centrifugado. Agregue 25 μL del colorante a un vial de matriz de gel. Agite bien la solución mezclada y gire hacia abajo.
   1. Transfiere la mezcla de gel y tinte a un filtro giratorio. Coloque el filtro de centrifugación en una microcentrífuga y centrifuga durante 10 min a temperatura ambiente a 1.500 x g ± 20%.
      NOTA: Proteja la solución con un tinte de la luz y guárdela a 4 °C después de su uso. La mezcla de gel y tinte se puede utilizar para unas 15 patatas fritas una vez preparada. Deje que la mezcla de gel y tinte se equilibre a temperatura ambiente durante 30 minutos cada vez antes de usarla.
5. Cargue la mezcla de gel y tinte
   1. Inserte un nuevo chip de ADN en la estación de cebado. Agregue 9 μL de mezcla de gel y tinte en el pocillo marcado con "G". Asegúrese de que el émbolo esté colocado en la marca de 1 ml y luego cierre la estación de cebado.
   2. Presione el émbolo de la jeringa hacia abajo hasta que el clip lo sostenga. Espere exactamente 30 segundos y luego suelte el clip. Espere 5 segundos y, a continuación, vuelva a colocar lentamente el émbolo en la posición de 1 ml.
   3. Abra la estación de cebado y agregue 9 μL de mezcla de gel y colorante en los pocillos marcados con "G".
6. Agregue 5 μL de marcador en el pozo marcado con el símbolo de la escalera y también agregue 5 μL de marcador en cada uno de los 12 pocillos de muestra. No dejes ningún pozo vacío.
7. Agregue 1 μL de escalera de ADN en el pozo marcado con el símbolo de la escalera. Agregue 1 μL de producto PCR (pocillos usados) o 1 μL de agua ultrapura (pocillos no utilizados) en cada uno de los 12 pocillos de muestra. Coloque el chip horizontalmente en el adaptador del mezclador de vórtice y vórtice durante 1 minuto en la configuración indicada (2.400 rpm).
8. Inserte el chip en el instrumento bioanalizador y ejecute el chip en el instrumento dentro de los 5 minutos.
9. Una vez finalizado el ensayo, retire inmediatamente el chip usado del instrumento.
10. Agregue lentamente 350 μL de agua desionizada en uno de los pocillos del limpiador de electrodos. Abra la tapa del bioanalizador y coloque el limpiador de electrodos en él. Cierre la tapa e incube durante unos 10 s. Abra la tapa y retire el limpiador de electrodos. Espere otros 10 segundos para permitir que el agua de los electrodos se evapore y luego cierre la tapa.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: tubos de PCR de 0,2 ml	Axygen	PCR-02D-C
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: 1x tampón TE, pH 8,0, sin arnana	Ambiente	AM9849
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Instrumento Bioanalyzer 2100	Agilent	G2939AA
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: placa de PCR de 96 pocillos	Termo Fisher	AB0800
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Cartucho de electrodos	Agilent		Suministra el equipo del instrumento Bioanalyzer 2100
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Mezclador de vórtice IKA	Agilent		Suministra el equipo del instrumento Bioanalyzer 2100
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Software de dimensionamiento 2100 Software experto	Agilent		Suministra el equipo del instrumento Bioanalyzer 2100
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Chips de prueba	Agilent		Suministra el equipo del instrumento Bioanalyzer 2100
Kit Agilent DNA 7500	Agilent	5067-1506	Para el tamaño de fragmentos
Kit Agilent DNA 7500: DNA 7500 Ladder (tapa amarilla)	Agilent		En kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Marcadores DNA 7500 (tapa verde)	Agilent		En kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: chips de ADN	Agilent		En kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Concentrado de colorante de ADN (tapa azul)	Agilent		En kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Vial de matriz de gel de ADN (tapa roja)	Agilent		En kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Limpiador de electrodos	Agilent		En kit: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Filtro de centrifugado	Agilent		Suministros del kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Jeringa	Agilent		Suministros del kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Estación de cebado de virutas	Agilent	5065-4401	Suministra el equipo del instrumento Bioanalyzer 2100
Colector de vacío de placa de filtro: Colector de vacío MultiScreenHTS	Merck Millipore	MSVMHTS00	Instrumento de vacío para colector de vacío de placa de filtro para la purificación de productos PCR
Colector de vacío de placa de filtro: Tapón de silicona	Merck Millipore	XX2004718	Colector de vacío de placa filtrante
Colector de vacío de placa de filtro: Bomba de vacío	Merck Millipore	WP6122050	Colector de vacío de placa filtrante
Colector de vacío de placa filtrante: Recipiente de recogida de residuos	Merck Millipore	XX1004705	Colector de vacío de placa filtrante