SDS no reductor PAGE: Un método para analizar complejos de proteínas multiméricas ligados a disulfuro

Resumen

Fuente: Rotoli, S. M. et al., Combinación de análisis SDS-PAGE no reductor y reticulación química para detectar complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro en células de mamíferos en cultivo. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la técnica de separación de las muestras de proteínas mediante SDS-PAGE no reductor para analizar los complejos de proteínas multiméricas. Esta técnica retiene las subunidades multímeras de una proteína sostenidas por los enlaces disulfuro que luego pueden ser analizadas por Western blot.

Protocolo

>1. Bloqueo de residuos de cisteína libre mediante yodoacetamida

1. Cultive células U-2 OS en una placa de 6^cm2 con una confluencia del 50%-60% en un medio esencial mínimo con un alto contenido de glucosa que contenga un 10% de suero fetal bovino y un 1% de piruvato de sodio a 37 °C en 5% de CO₂.
2. Prepare una reserva fresca de 10 mM de yodoacetamida justo antes de usar, luego deseche cualquier reactivo no utilizado.
3. Añadir yodoacetamida de concentración final de 0,1 mM directamente al medio de cultivo celular. Agita suavemente el plato a temperatura ambiente durante 2 min.

>2. Cosechando las células

1. Aspire el medio de las células.
2. Lave las células con 5 mL de solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) tres veces. Aspire la solución de lavado final de PBS y luego agregue 1 ml de PBS frío.
3. Raspe las células del fondo del plato con un raspador de células. Con una pipeta de 1 mL, extraiga el PBS y la suspensión celular y dispense todo el líquido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
4. Centrifugar las celdas a 7.500 x g durante tres minutos a 4 °C. Aspirar el PBS, dejando atrás la pastilla de celdas. El pellet de celda se puede almacenar a -80 °C hasta el procesamiento

3. Extracción de proteínas

1. Preparar 100 μL de un tampón de lisis 1x diluido en ddH₂O (Ver Tabla de Materiales). Agregue fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) inmediatamente antes de usar hasta una concentración final de 1 mM.
2. Añada 50 μL del tampón de lisis 1x directamente al pellet de la célula y suspenda. Incuba esto en hielo durante 5 min.
3. Sonicar durante 8 s utilizando el modo de pulso constante al 40% (véase la Tabla de materiales para el sonicador; ajuste según sea necesario para diferentes sonicadores), manteniendo el extracto en hielo.
4. Centrifugar el extracto a 4 °C durante 5 min a 16.000 x g. El sobrenadante es la fracción proteica soluble. El análisis de Bradford se puede realizar para determinar la concentración de proteínas si se desea.

4. Preparación de la muestra

1. Tome 10 μL del extracto de proteína soluble y agregue 10 μL de un tampón de muestra Laemmli SDS 1x (4% SDS, 20% glicerol, 0,004% azul de bromofenol y 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). No añada ningún reactivo reductor.
2. Mantenga las muestras en hielo si el análisis SDS PAGE se va a realizar ese día; para el almacenamiento a largo plazo, -20 °C es apropiado. Justo antes de hacer funcionar el gel, caliente la muestra durante 5 minutos a 85 °C.

>5. Reticulación de formaldehído in vivo de proteínas endógenas en células U-2 OS

1. Cultive células U-2 OS en un matraz de 175^cm2 con una confluencia del 70 % al 80 %.
2. Realizar la reacción de reticulación de formaldehído
   1. En una campana extractora, alícuota una solución de formaldehído al 37% comprada de fuentes comerciales. Agregue el fijador de formaldehído directamente al medio hasta una concentración final del 1% e incube a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos.
   2. Para apagar la reacción, agregue glicina 1,25 M a una concentración final de 0,125 M e incube a temperatura ambiente con agitación suave en un balancín durante 5 min.
3. Lave las células con 5 mL de PBS frío tres veces. Aspire la solución de lavado final de PBS y agregue 10 mL de PBS. Raspe las células del fondo del matraz con un raspador de celdas.
4. Con una pipeta de 10 mL, extraiga el PBS y la suspensión celular y dispense todo el líquido en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL. Girar las celdas a 500 x g durante 2 min a 4 °C. Aspirar el PBS, dejando atrás el pellet de la celda.

>6. Fraccionamiento de núcleos

1. Prepare 10 mL de tampón de homogeneización: 0,25 M de sacarosa, 1 mM de EDTA, 10 mM de HEPES y 0,5% de BSA a pH 7,4. Agregue PMSF inmediatamente antes de usar a una concentración final de 1 mM y 3 mL de tampón de suspensión de núcleos (0.1% Triton X-100 en PBS).
2. Agregue 5 mL de tampón de homogeneización directamente al pellet de celda y suspenda completamente. Centrifugar la suspensión a 500 x g durante 2 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
3. Suspender el pellet en 5 mL de tampón de homogeneización. Utilice un homogeneizador de vidrio y teflón ajustado, homogeneice las celdas a 10 carreras/500 rpm.
4. Centrifugar la suspensión a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C, luego desechar el sobrenadante.
   NOTA: Utilice el sobrenadante para el aislamiento de mitocondrias centrifugando a 10.000 x g durante 10 min.
5. Suspenda el pellet en un tampón de suspensión de núcleos de 1 mL e incube en hielo durante 10 min.
6. Centrifugar a 600 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante.
7. Suspenda el pellet en un tampón de suspensión de núcleos de 1 mL y vuelva a centrifugar. Deseche el sobrenadante. La bolita final serán núcleos aislados.

>7. Extracción de proteínas

1. Repita la sección 4, excepto añadiendo 25 μL del tampón de lisis 1x directamente al pellet de la célula y luego suspendiéndolo.

>8. Preparación de la muestra

1. Prepare dos muestras para SDS-PAGE tomando 10 μL de cada uno del extracto de proteína soluble y agregue 10 μL de 2x tampón de muestra Laemmli SDS y 1 μL de 2-Mercaptoetanol (BME).
2. Calentar una muestra durante 5 min a 37 °C y la segunda muestra durante 15 min a 98 °C para revertir la reticulación del formaldehído.

9. Análisis SDS-PAGE

1. Prepare 1 L de 1x tampón de funcionamiento de Tris-glicina (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 0,1% (p/v) de SDS).
2. Configurar el aparato en ejecución SDS-PAGE.
   NOTA: Este protocolo utiliza una página SDS TGX prefabricada del 16%. Cabe destacar que se puede utilizar cualquier porcentaje de gel.
   1. Según el protocolo del fabricante, abra el paquete en el que se almacena el gel y retire el casete.
   2. Retire el peine que está recubriendo los pocillos y la cinta de la parte inferior del casete.
   3. Coloque el gel en el aparato para correr.
   4. Llene la cámara con el tampón de funcionamiento 1x hasta que los pozos se sumerjan en líquido. Con una pipeta de plástico, enjuague los pocillos con el tampón de funcionamiento.
3. Cargue las muestras en el gel junto con 10 μL de marcador estándar preteñido.
4. Pasa el gel a 200 V hasta que el frente del tinte esté aproximadamente a 1 cm del fondo del gel.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
16% geles TGX prefabricados	ThermoFisher	XP00160
Azul de bromofenol
Bsa	Señalización celular	99985
Tampón de lisis celular	Señalización celular	9803
centrífuga	Eppendorf	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Aparato de electroforesis	Invitrogen	A25977
Suero fetal bovino	Gibco	1932693
Formaldehído	ThermoFisher	28908
Homogeneizador de vidrio y teflón
glicerol	Sigma Aldrich	65516
glicina	Rpi	636050
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Yodoacetamida	ThermoFisher	90034
Pbs	Sigma Aldrich	P3813
fuente de alimentación	Biorad	Año 200120
Rotulador prestained	ThermoFisher	26619
Sds	Biorad	161-0302
Sonicador	Branson	450
Base Tris	Rpi	T60040
Solución salina tamponada Tris	Sigma Aldrich	SRE0031	con Tween 20, pH 7.5
Tampón de carrera Tris-Glycine	VWR	J61006
Tritón X-100	Sigma Aldrich	T8787
Sistema operativo U-2	ATCC	HTB-96