Enfoque isoeléctrico en fase líquida: una técnica de electroforesis para separar moléculas bioactivas del extracto crudo de Gymnema sylvestre

Resumen

Fuente: Veerapandian, R., et al. Separación de Pequeñas Moléculas Bioactivas, Péptidos de Fuentes Naturales y Proteínas de Microbios mediante el Método de Enfoque Isoeléctrico Preparativo (IEF). J. Vis. Exp. (2020).

Este video describe una técnica para separar moléculas complejas de extractos de plantas utilizando enfoque isoeléctrico en fase líquida. Esta técnica ayuda a purificar biomoléculas complejas en su estado nativo, que se pueden utilizar para diversas aplicaciones posteriores.

Protocolo

>1. Separación y purificación de pequeñas moléculas y péptidos a partir de extracto de Gymnema sylvestre

1. Mida 0,6 g de extracto de planta y disuelva en agua destilada (60 mL) mezclando en un tubo de rodillo durante 5 min.
   NOTA: Cualquier muestra biológica que sea soluble y libre de sal se puede utilizar para la separación y purificación utilizando un instrumento de enfoque isoeléctrico (IEF) en fase líquida. Las muestras con una concentración de sal tampón de hasta 10 mM se pueden utilizar con una resolución ligeramente disminuida.
2. Centrifugar el extracto vegetal solubilizado a 10.000 x g durante 5 min para eliminar las partículas insolubles.
3. Transfiera el sobrenadante (~60 mL) a un tubo de centrífuga de 80 mL y mézclelo con 0,6 mL de anfolito (pH 3-10) al 1% (v/v).
4. Prepare la unidad IEF en fase líquida.
   1. Ensamble los electrodos IEF en fase líquida (botón rojo ánodo y botón negro cátodo) con sus respectivas membranas de intercambio de acuerdo con el manual de instrucciones (Tabla de materiales). Equilibrar las membranas de intercambio aniónico con 0,1 M de NaOH y las membranas de intercambio catiónico con 0,1 M H₃PO₄ al menos durante 16 h cuando se utilicen nuevas membranas.
   2. Almacene las membranas en electrolitos (0,1 M NaOH o 0,1 M H₃PO₄) entre pasadas y no permita que se sequen.
   3. Ensamble la parte interna y externa del electrodo alineando tres orificios oblongos en las juntas de intercambio iónico. Llene los electrodos con los electrolitos respectivos (~25-30 mL) para evitar que sus membranas se sequen.
   4. No agregue exceso (más de 1/3 del volumen de la cámara del electrodo) electrolito que pueda acumular presión dentro del electrodo y causar fugas.
   5. Cubra los puertos de recolección de muestras con cinta de sellado que viene con las piezas del ensamblaje del instrumento (Tabla de materiales). El lado de los puertos de recolección de muestras se puede identificar por los dos pines de alineación metálicos verticales. Alternativamente, use cinta de sellado estándar para sellar los puertos.
   6. Ensamble todas las partes del conjunto de la cámara de enfoque en secuencia (electrodo de ánodo, núcleo de membrana de nylon, cámara de enfoque y electrodo de cátodo) sobre el dedo de enfriamiento cerámico.
   7. Llene la cámara de enfoque con agua destilada preenfriada (volumen total de 60 mL para la celda IEF estándar) usando una jeringa de 50 mL.
   8. Conecte el instrumento IEF en fase líquida a un agua de refrigeración circulante a 4 ºC y prehaga funcionar la unidad a 15 W y 3.000 V durante 3-5 minutos o hasta que el voltaje se estabilice.
      NOTA: Generalmente, dentro de un minuto, el voltaje alcanzará los valores máximos establecidos. La preejecución con agua destilada ayuda a eliminar los iones residuales de la cámara de enfoque y el núcleo de la membrana de nailon.
   9. Apague la fuente de alimentación y elimine el agua de la celda usando el colector de fracciones. Vuelva a sellar los puertos de recolección con cinta de sellado. La cámara ya está lista para cargar la muestra.
5. Utilice una jeringa de 50 mL con una aguja roma de 1-1/2 pulgada y 19 G (viene con el instrumento) y cargue la muestra preparada con anfolito (60 mL en total) en la celda a través de los puertos de recolección de muestras.
6. Elimine las burbujas de aire de la celda de muestra retirando la celda de enfoque del soporte y golpeando la cámara de electrodos para desalojar las burbujas. La presencia de burbujas de aire causará fluctuaciones de voltaje y corriente y afectará el funcionamiento.
7. Conecte la unidad al refrigerante de agua (4 °C) e inicie el fraccionamiento con la fuente de alimentación a una velocidad constante de 15 W.
8. Haga funcionar el aparato durante 3 h o hasta que el voltaje alcance un valor constante.
   NOTA: A medida que la muestra comienza a enfocarse, el voltaje comenzará a subir gradualmente hasta que alcance un valor constante.
9. Después de la carrera, prepárese para recoger las fracciones en la caja de cosecha (que contiene 20 tubos de plástico, 12 mm x 75 mm, volumen de 5-6 mL) conectada a la bomba de vacío presionando el botón de cosecha ON en la unidad IEF.
10. Alinee los 20 pines de recolección con los 20 puertos de recolección de la celda de enfoque que está sellada con la cinta.
11. Empuje los pasadores de recolección a través de la cinta de sellado y encienda la bomba de vacío simultáneamente (Figura 1B, 1C y 1D).
    NOTA: Se recogerán aproximadamente fracciones de 3 ml de cada cámara en los tubos para cada vez. Las fracciones se pueden utilizar para aplicaciones posteriores posteriores (SDS-PAGE para la cuantificación de péptidos, TLC y bioensayo para moléculas pequeñas).

Resultados

Figura 1: Configuración y fraccionamiento del aparato IEF en fase líquida del extracto de planta de G. sylvestre. (A) Durante la ejecución, (B) durante la recolección de fracciones, (C) después de la recolección de fracciones, y (D) partes de aparatos IEF en fase líquida, 1) membranas de intercambio iónico, 2) cámara de enfoque y núcleo de membrana, 3) conjunto de electrodos (negativo), 4) ens...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de jeringa de 0,45 μm	Fisher scientfic	09-720-004
Bio-Lyte 3/10 Anfolyte	Bio-Rad	Números 163-1113
Bio-Lyte 5/8 Anfolyte	Bio-Rad	163-1192
Termostato compacto de baja temperatura	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Ajuste la refrigeración del agua a 4 °C y puede funcionar incluso a 0 °C, ya que cuando pasa a través del núcleo de refrigeración del Rotofor, la temperatura del agua circulante será de alrededor de 5 o más dependiendo del voltaje.
Polvo de extracto de hoja de planta Gymnema (>25% de ácidos gimnémicos)	Suan Farma, Nueva Jersey, Estados Unidos
Mini electroforesis proteica	Bio-Rad
Medidor de pH	Mettler Toledo	S20	Útil para determinar el pH de las fracciones de Rotofor (IEF en fase líquida)
Rotofor	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Manual de instrucciones de Rotofor para el montaje de la unidad)
RPMI-1640 Medio	HyClone	DH30255.01
Cinta de sellado	Bio-Rad	170-2960	También se puede usar cinta adhesiva
Centrífuga Sorvall legend micro 17	Termo científico	75002432