Electroforesis capilar de afinidad por cambio de movilidad: un método para analizar las interacciones muestra-ligando en función de la migración diferencial de los complejos proteína-ligando

Resumen

Fuente: Nachbar M. et al., Análisis del desorden intrínseco de AtHIRD11 y la unión hacia iones metálicos mediante electroforesis en gel capilar y electroforesis capilar de afinidad. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe el método para analizar la interacción proteína-ligando mediante electroforesis capilar de afinidad por cambio de movilidad. Este método se puede utilizar para caracterizar el comportamiento de unión de una proteína con varios ligandos cargados.

Protocolo

1. Preparar las soluciones para el análisis ACE

1. Prepare la solución de NaOH 1 M.
   1. Pesar 4,0 g de NaOH en un matraz aforado de 100 mL.
   2. Llénalo hasta la marca con agua desionizada para hacer un caldo de 1 M.
2. Prepare el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,1 M en una solución de NaOH 0,1 M.
   1. Transfiera 10 mL de NaOH de 0,1 M en un matraz aforado de 100 mL utilizando una pipeta de bulbo de 10 mL. Llénalo hasta la marca con agua desionizada.
   2. Pesar 2,42 g de EDTA en un recipiente de pesaje y disolver el compuesto sólido en los 100 mL de NaOH 0,1 M.
3. Prepare la solución tampón Tris (30 mM).
   1. Agregue 3,63 g de Tris, 200 ml de agua desionizada y una barra agitadora en un vaso de precipitados de 500 ml. Coloque el vaso de precipitados en una placa para agitar y enciéndalo.
   2. Coloque un electrodo medidor de pH en el vaso de precipitados y ajuste el pH a 7,4 usando 0,1 M HCl.
   3. Llene la solución en un matraz aforado de 1 L y llénelo hasta la marca con agua desionizada.
      NOTA: Este procedimiento debe repetirse o se necesita un matraz volumétrico más grande, ya que se necesita más de 1 L para todo el análisis.
4. Prepare la solución de marcador de flujo electroosmótico (EOF) de acetanilida (60 μM).
   1. Añadir 6 mg de acetanilida y 100 mL de tampón Tris en un matraz aforado de 100 mL.
   2. Coloque el matraz aforado en un baño ultrasónico y enciéndalo durante 30 minutos.
5. Prepare la muestra (1 mg/mL) de solución.
   1. Coloque un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en una balanza de precisión y añada 0,3 mg de polvo de AtHIRD11 liofilizado en el tubo.
   2. Utilice una micropipeta para añadir 0,3 mL de un tampón Tris de 30 mM (pH 7,4) en el tubo. Agite el tubo con cuidado para disolver la proteína.
6. Prepara las soluciones de ligando.
   1. Prepare la solución madre de CaCl₂ (5 mM).
      1. Tome un bote de pesaje, colóquelo en una balanza analítica y pese 36,76 mg de CaCl₂ * H₂O.
      2. Con una micropipeta, enjuague el CaCl₂*H₂O del recipiente de pesaje en un matraz aforado de 50 ml con el tampón Tris previamente preparado.
      3. Llene el matraz aforado con el tampón Tris hasta la marca.
   2. Prepare las soluciones madre restantes (5 mM).
      1. Repita el paso 1.6.1 utilizando las otras sales metálicas en lugar de CaCl₂*H₂O [MgCl₂: 23,80 mg, BaCl₂: 26,02 mg, Sr(NO₃)₂: 52,91 mg, MnCl₂: 31,46 mg, SeCl₄: 52,91 mg, CoCl₂*2H₂O: 41,47 mg, CuCl₂*2H₂O: 42,62 mg, ZnCl₂: 3,41 mg y NiCl₂*6H₂O: 59.43 mg].
         nota: La solución de ZnCl₂ tiene una concentración de 0,5 mM. Dado que se observaron fuertes interacciones entre los iones y la pared capilar interna, la concentración se redujo en un factor de 10⁴.
   3. Prepare la solución de 500 μM de CaCl₂.
      1. Llene 10 mL de la solución madre de CaCl₂ y colóquela en un matasco aforado de 100 mL.
      2. Llene el matraz aforado con un tampón Tris hasta la marca y agite el matraz.
   4. Prepare la solución de 250 μM de CaCl₂.
      1. Llene 5 mL de la solución madre de CaCl₂ y colóquela en un matraz aforado de 100 mL.
      2. Llene el matraz aforado con un tampón Tris hasta la marca y agite el matraz.
   5. Repita los pasos anteriores para las otras soluciones madre.
7. Llene las soluciones en los viales.
   nota: Cada ejecución repetida necesita un juego de viales de entrada y salida. El uso de soluciones de ligandos frescos en la entrada y la salida reduce los cambios en el tiempo de migración después de cada ejecución.
   1. Llene la solución de 250 μM de CaCl₂ en una jeringa de 10 mL.
   2. Coloque un filtro de PVDF de 0,22 μm en la jeringa y empuje 2 ml de la solución a través del filtro con la jeringa para desechar esta solución filtrada.
   3. Llene 10 viales hasta el volumen máximo permitido con los 250 μM restantes de solución de CaCl₂ de la jeringa. Marque cada uno como vial de entrada de solución de 250 μM de CaCl₂.
   4. Llene 10 viales hasta que estén llenos hasta la mitad con la solución de 250 μM de CaCl₂. Marque cada uno como vial de salida de solución de 250 μM de CaCl₂.
   5. Repita los pasos 1.7.1 - 1.7.4 para las otras soluciones que contienen sales metálicas.
   6. Repita los pasos para cada par de viales de entrada y salida utilizando la solución tampón Tris de 30 mM (pH 7,4) en su lugar.
      nota: El tampón Tris de 30 mmol/L pH 7,4 se utiliza entre las corridas para obtener datos de tiempo de migración de la proteína en ausencia de iones metálicos. Es necesario descuidar los cambios en el EOF.
   7. Repita los pasos anteriores para un vial utilizando la solución de marcador EOF de acetanilida (60 μM) en su lugar. Además, repita estos pasos usando la solución de muestra (1 mg/mL) en su lugar.

>2. Análisis electroforético capilar de afinidad

1. Acondicionar el capilar
   1. Ajuste el termostato a 23 °C.
      nota: La temperatura se utiliza de acuerdo con los protocolos publicados y se puede cambiar a otras temperaturas. Sin embargo, las interacciones dependen de la temperatura y cambiarán en consecuencia.
   2. Enjuague un capilar durante 40 min a 2,5 bar con NaOH 0,1 M.
   3. Enjuague el capilar durante 10 min a 1,0 bar con agua desionizada.
   4. Enjuague el capilar durante 30 min a 1,0 bar con un tampón Tris de 30 mM (pH 7,4).
2. Preparación para los métodos ACE
   1. Prepare el método para las mediciones sin ligandos.
      nota: No se añadió acetanilida a la solución de muestra, ya que disimula 2 picos de proteínas.
      1. Enjuague el capilar durante 1 minuto a 2,5 bar con una solución de EDTA 0,1 M.
      2. Enjuague el capilar durante 1 minuto a 2,5 bar con agua desionizada.
      3. Enjuague el capilar durante 1,5 min a 2,5 bar con un tampón Tris para equilibrarlo.
      4. Inyectar la solución de acetanilida durante 6 s a 0,05 bar y cambiar los viales de entrada y salida por los viales tampón Tris.
      5. Aplique 0,05 bar durante 2,4 s para empujar la solución de acetanilida desde la punta del capilar hacia el interior.
      6. Aplique 10,0 kV durante 6 minutos y detecte el pico de acetanilida a una longitud de onda de 200 nm.
      7. Repita los pasos 2.2.1.1. - 2.2.1.6. utilizando la muestra de proteína en lugar de la solución de acetanilida y detecte todos los picos de proteína.
   2. Prepare el método para las mediciones con ligandos.
      1. Enjuague el capilar durante 1 minuto a 2,5 bar con una solución de EDTA 0,1 M.
      2. Enjuague el capilar durante 1 minuto a 2,5 bar con agua desionizada.
      3. Enjuague el capilar durante 1,5 min a 2,5 bar con la solución de ligando para equilibrarlo.
      4. Inyectar la solución de acetanilida durante 6 s a 0,05 bar y cambiar los viales de entrada y salida por los viales tampón que contienen ligando.
      5. Aplique 0,05 bar durante 2,4 s para empujar la solución de acetanilida desde la punta del capilar hacia el interior.
      6. Aplique 10,0 kV durante 6 minutos y detecte el pico de acetanilida a una longitud de onda de 200 nm.
      7. Repita los pasos 2.2.2.1 - 2.2.2.6 utilizando la muestra de proteína en lugar de la solución de acetanilida y detecte todos los picos de proteína.
   3. Repita alternativamente los pasos 2.2.1 y 2.2.2 para calcular el cambio en las relaciones carga-tamaño para las diversas interacciones proteína-metal ionion.
      1. Cambie la solución proteica después de cada 60 h por una nueva.
         nota: En este punto, el experimento se puede pausar. Este procedimiento se repite al menos 10 veces para cada concentración de los ligandos, ya que el patrón de picos varía ligeramente de una ejecución a otra. Si la solución se utiliza durante más de 60 h, las variaciones se vuelven demasiado grandes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ejemplo de AtHIRD11	Universidad de Shizuoka (Grupo Prof. M. Hara)		Proteína dehidrina de Arabidopsis thaliana expresada en Escherichia coli
Capilar de sílice baveterada,	Polymicro Technologies (Phoenix, EE. UU.)	106815-0017	TSP050375 50 μm de diámetro interior, 363 μm de diámetro exterior, recubrimiento de poliimida
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Alemania)		Instrumento de electroforesis capilar; En su lugar, se puede utilizar Agilent 7100 CE
Pipeta de bulbo 25 mL	Duran Group GmbH(Maguncia, Alemania)	24 338 14	Preparación de la solución de ligando
Matraz aforado Duran glas 25 mL	Duran Group GmbH(Maguncia, Alemania)	24 671 1457	Preparación de la solución madre de ligando
Matraz aforado Duran glas 10 mL	Duran Group GmbH(Maguncia, Alemania)	24 671 1054	Preparación de la solución madre de ligando
Acetanilida	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania)	397229-5G	Marcador de flujo electroosmótico
Cloruro de manganeso (II)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania)	13217	ligando
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania)	431788-100G	Ingrediente de enjuague
Cloruro de bario	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania)	202738-5G	ligando
Cloruro de níquel (II) hexahidratado	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania)	654507-5G	ligando
Cloruro de selenio (IV)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania)	323527-10G	ligando
2-amino-2-hidroximetilpropano-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania)	252859-100G	Ingrediente tampón
Cloruro de zinc (II)	Merck Millipore (Darmstadt, Alemania)	1088160250	ligando
Nitrato de estroncio	Merck Millipore (Darmstadt, Alemania)	1078720250	ligando
Cloruro de calcio dihidratado	Merck Millipore (Darmstadt, Alemania)	1371015000	ligando
Cloruro de cobre (II) dihidratado	Riedel-de Haën (Seelze, Alemania)	31286	ligando
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Alemania)	G2070-91126	Paquetes de software para operar los instrumentos CE, adquirir datos y evaluarlos