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1. Preparación de muestras
- Recoja tejidos de adenoma hipofisario (0,2 - 0,5 mg) del departamento de neurocirugía. Congele inmediatamente en nitrógeno líquido y luego transfiéralo a -80 °C para su almacenamiento.
- Añadir 2 mL de NaCl al 0,9% en agua destilada desionizada (ddH2O). Utilice esta solución para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido (3x).
NOTE: ddH2O con una conductividad de 18,2 MΩ/cm se utiliza en todo el protocolo. Es posible que parte del tejido se pierda al lavar la sangre de la superficie de un tejido.
- Añadir un volumen (10 mL; 4 °C) de la solución que contenga 2 M de ácido acético y 0,1% (v/v) de β-mercaptoetanol por cada 0,5 - 0,6 g de tejido, homogeneizar (1 min, 13.000 rpm, 4 °C, 10x) con un homogeneizador de tejidos, sonicar el homogeneizado durante 20 s, liofilizar y almacenar a -80 °C.
- Mida el contenido de proteínas de las muestras liofilizadas y homogeneizadas utilizando el kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
nota: La cuantificación de BCA no es una cuantificación absoluta, y el resultado medido se modificará con un técnico y un agente experimental diferentes. Se debe utilizar un patrón de muestra de concentración fija para diferentes experimentos. Por lo tanto, la cantidad final de carga de proteínas para cada gel 2D se determinará con la imagen de buena resolución teñida con plata o Coomassie en los experimentos prediseñados.
- Añadir unos 300 μg de la muestra homogeneizada liofilizada a un volumen (282 μL) de tampón de extracción de proteínas (8 M de urea y 4 % de CHAPS), seguido de una posición de reposo durante 2 h, sonicación en un baño de agua durante 5 min, rotación durante 1 h, sonicación de nuevo en el baño de agua durante 5 min, rotación de nuevo durante 1 h, y centrifugado a 15.000 x g durante 20 min.
- Prepare soluciones estándar BSA con las concentraciones mencionadas: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1,500, 2,000 μg/mL con el estándar comercial BSA (2 mg/mL).
- Mezcle los reactivos de BCA A y B (A:B = 50:1) como solución de trabajo de BCA antes de usar.
- Añadir 0,1 mL de la muestra o de la solución patrón a 2 mL de solución de trabajo de BCA en un tubo de microfuga, a continuación mezclar e incubar a 37 °C durante 30 min. Finalmente, deje enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos y mida el valor A de562 nm de diámetro exterior.
- Calcule la línea lineal estándar (A562 nm frente a la concentración de BSA) para obtener una ecuación de regresión para calcular el contenido de proteínas de la muestra con un valor de A562 nm.
- Utilice 150 μg de la muestra liofilizada de proteína equivalente para la tinción de plata, o 500 μg de proteína para la tinción de Coomassie, para una tira de gradiente de pH inmovilizado (IPG) de 18 cm pH 3-10 no lineal (NL).
nota: La tira seca IPG tiene un grosor de 0,5 mm y una anchura de 3 mm, con diferentes longitudes de 7, 11, 13, 18 y 24 cm, y diferentes rangos de pH, como pH 4-5, 4-7, 6-9 y 3-10 en un gradiente de pH lineal o no lineal. El tampón IPG utilizado debe ajustarse a la tira.
- Añadir 250 μL de tampón de extracción (7 M de urea, 2 M de tiourea, 4% (p/v) de CHAPS, 100 mM de DTT (añadir antes de usar), 0,5% v/v de farmalto (añadir antes de usar) y una traza de azul de bromofenol).
- Mantenga la solución por debajo de 30 °C, seguido de un vórtice durante 5 minutos, una sonicación durante 5 minutos y una rotación durante 50 minutos.
- Añadir 110 μL de tampón de rehidratación (7 M de urea, 2 M de tiourea, 4% (p/v) de CHAPS, 60 mM de DTT (añadir antes de usar), 0,5% v/v de tampón IPG (añadir antes de usar) y una traza de azul de bromofenol). Sonicar durante 5 min. A continuación, gire la muestra durante 50 minutos, el vórtice durante 5 minutos y centrifugar durante 20 minutos a 15.000 x g.
- Recoja el sobrenadante (350 μL) como solución de muestra de proteína.
>2. Electroforesis en gel bidimensional
- IEF (Primera dimensión): Realice IEF en el sistema de enfoque isoeléctrico como se describe a continuación.
- Añada 350 μL de la solución de muestra de proteínas en la ranura de un soporte de tiras de IPG de 18 cm.
- Coloque una tira de IPG de 18 cm con el gel hacia abajo sobre la solución de muestra de proteínas (evite las burbujas).
- Agregue 3-4 mL de aceite mineral para cubrir la tira de IPG.
- Ensamble el soporte de tiras IPG en el sistema de enfoque isoeléctrico con el extremo puntiagudo en la placa posterior (+) y el extremo cuadrado en la placa frontal (-).
- Rehidratar durante la noche (~18 h a temperatura ambiente).
- Ajuste los parámetros IEF: corriente máxima 30 μA por tira, 20 °C; 250 V, 1 h, 125 Vh, paso y retención; 1.000 V, 1 h, 500 Vh, gradiente; 8.000 V, 1 h, 4.000 Vh, gradiente; 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, paso y retención; y 500 V, 0,5 h, 250 Vh, paso y retención. Déjalo funcionar hasta un tiempo total de 7,5 h y 36.875 Vh.
- Después de la IEF, saque cada tira de IPG y retire el aceite mineral extra con una toalla de papel insoluble. Ahora envuelva la tira en una hoja de papel film y guárdela a -80 °C.
nota: El soporte de tiras IPG debe limpiarse con la solución de limpieza del soporte de tiras IPG y agua destilada.
- SDS-PAGE (segunda dimensión): Realice SDS-PAGE en un sistema de electroforesis de celda vertical
nota: El tamaño de cada gel SDS-PAGE debe ser de 255 x 190 x 1 mm.
- Use un rodillo multigel para moldear geles resolutivos PAGE al 12%. Para fundir geles PAGE al 12%, realice los siguientes pasos.
- Añadir 270 mL de ddH2O, 150 mL de Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 180 mL de solución madre de acrilamida/bisacrilamida al 40% (p/v) (29:1, 40% p/v de acrilamida y 1,38% p/v de N, N'-metilenebisacrilamida), 3 mL de persulfato de amonio al 10% y 150 μL de TEMED para hacer la solución de gel en un vaso de precipitados. Mezclar suavemente y evitar las burbujas.
- Vierta la solución de gel suavemente en la cámara de multidifusión hasta la altura de gel esperada (19 cm).
- Agregue inmediatamente aproximadamente 3 mL ddH2O en cada gel resolutivo para cubrir los geles. Deje que el gel polimerice durante aproximadamente 1 h.
- Prepare 20 L de tampón de electroforesis (25 mM de Tris, 192 mM de glicerina y 0,1% de SDS). Llene el tanque intermedio de la unidad de separación por electroforesis con este tampón.
- Saque las tiras de IPG enfocadas del congelador y equilibre las tiras durante 10 minutos meciendo suavemente 4 mL de tampón de equilibrio reductor (375 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 6 M de urea, 2% (p/v) de SDS, 20% (v/v) de glicerol, 2% p/v de DTT (añadir antes de usar) y una traza de azul de bromofenol).
- Equilibre durante 10 minutos meciendo suavemente las tiras de IPG reducidas en 4 mL de tampón de equilibrio de alquilación (375 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 6 M de urea, 2% (p/v) de SDS, 20% (v/v) de glicerol, 2,5% p/v de yodoacetamida (añadir antes de usar) y una traza de azul de bromofenol).
- Durante el equilibrio del gel, desmonte la cámara de multifundición y saque el casete de gel de resolución preparado. Enjuague 3 veces con ddH2O. Retire el exceso de ddH2O con una toalla de papel insoluble y colóquelo en un soporte de gel.
- Enjuague las tiras de IPG equilibradas con un tampón de electroforesis y elimine el exceso de líquido en la superficie de la tira de IPG con la toalla de papel insoluble.
- Coloque una tira de IPG en el gel SDS-PAGE de resolución y deje que el lado de plástico de la tira de IPG entre en contacto con la placa de vidrio más larga y el extremo puntiagudo hacia la izquierda.
- Vierta rápidamente 3-4 mL de agarosa caliente al 1% en el tampón de electroforesis SDS (~80 °C) para sellar la tira de IPG en la parte superior de cada gel SDS-PAGE, y coloque la parte superior de la tira de IPG hasta la parte superior de la placa de vidrio más corta sin burbujas, y luego polimerice durante 10 min.
- Inserte el casete de gel ensamblado verticalmente entre las juntas de plástico en el sistema de electroforesis vertical. Coloque la parte superior del gel con la tira de IPG junto al cátodo (−).
- Ajuste el nivel de tampón de electroforesis para sumergir el casete de gel.
- Conecte y configure la fuente de alimentación/unidad de control en modo de voltaje constante y haga funcionar a 200 V durante aproximadamente 370 minutos mientras monitorea el tinte.
- Después de correr, saque el casete de gel del sistema de electroforesis y retire suavemente el gel del casete de gel, evitando rasgar el gel, seguido de la tinción de las proteínas separadas por 2DE.