Electroforesis en gel de zimografía: una técnica electroforética para detectar metaloproteinasas de matriz mediante la evaluación de la actividad enzimática

Resumen

Fuente: Hu, X. et al., Detección de metaloproteinasas de matriz funcional por zimografía. J. Vis. Exp. (2010)

Este video muestra la técnica de electroforesis en gel de zimografía para evaluar la actividad de las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) presentes en el sobrenadante de cultivo celular. Las MMP activas degradan el sustrato específico de MMP incrustado en un gel de poliacrilamida, que aparece como bandas transparentes sobre un fondo teñido oscuro después de la tinción.

Protocolo

1. Carga y funcionamiento del gel

1. Todas las muestras deben prepararse adecuadamente para mantener la función de las enzimas y utilizarse inmediatamente después de la recogida o almacenarse congeladas a -80 °C. Las muestras no deben contener agentes reductores (como el β-mercaptoetanol) ni hervirse antes de la carga del gel.
2. Abra la bolsa que contiene un gel dentro de un casete, enjuague el casete con agua desionizada.
   1. Retire la cinta protectora de la parte inferior del casete y el peine de la parte superior del gel.
   2. Enjuague los pocillos tres veces con tampón corriente (diluido a 1X en agua desionizada).
   3. Coloque el gel en la Mini-Cell, asegurándose de que el lado más pequeño del casete mire hacia adentro. Asegúrelo en su lugar con la cuña de tensión de gel. La Mini-Cell permite ejecutar uno o dos geles en paralelo.
   4. Llene la cámara superior (interior) con un tampón de funcionamiento 1X por encima del nivel de los pozos, compruebe si hay fugas. En caso de fugas, retire el tampón y vuelva a colocar el gel.
   5. Llene la cámara inferior con un tampón de funcionamiento 1X.
3. Cargue 10 μL de marcador molecular de proteína en un pocillo.
   1. Mezcle una cantidad igual de tampón de carga de gel y de muestra y cargue en los pocillos del gel utilizando puntas de carga de gel (cambiadas entre cada muestra). Estos pocillos se pueden cargar con hasta 20 μL en total.
4. Coloque la tapa en la minicelda y conecte los cables de electrodos a la fuente de alimentación. Encienda la fuente de alimentación y configúrela para que funcione a 125 V constante durante 90 minutos. Verifique la formación de pequeñas burbujas en el cable de la cámara inferior, lo que indica la circulación de corriente.
5. Al ejecutar su primer gel, controle el progreso de la migración cada 15 minutos, utilizando el azul de bromofenol incluido en el tampón de carga como indicador. Deja que el gel corra hasta que el tinte indicador llegue al fondo del gel.

>2. Renaturalización y desarrollo del gel

1. Para cada gel, prepare 100 mL de tampón de renaturalización 1X y 200 mL de tampón desnaturalizante, ambos en agua desionizada.
2. Cuando el tinte de seguimiento azul de bromofenol llegue al fondo del gel, apague la fuente de alimentación, abra la Mini-Cell y retire el gel. Separe los dos lados del casete con el cuchillo de gel (o una espátula de pesaje). Corta una esquina para marcar la dirección del gel.
3. Retire con cuidado el gel del casete y colóquelo en un recipiente con 100 ml de tampón de renaturalización. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave.
4. Retire el tampón renaturalizante y agregue 100 ml de tampón revelador al gel. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave.
5. Retire el tampón revelador y agregue 100 ml más de tampón revelador al gel. Incubar durante la noche (16-18 horas) a 37°C.
6. Retire el tampón revelador y enjuague tres veces (5 minutos cada una) con agua desionizada bajo agitación suave a temperatura ambiente.
7. Escanee el gel para guardar la posición exacta de las bandas estándar de proteínas, ya que se volverán menos o no serán visibles después de la tinción con gel.
8. Tiñe el gel añadiendo 20 ml de SimplyBlue Safestain al gel. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente bajo una agitación suave.
9. Retire el SimplyBlue SafeStain y elimine las manchas del gel en 100 ml o más de agua desionizada durante una hora a temperatura ambiente con una agitación suave.
10. Para obtener mejores resultados, reemplácelo con agua desionizada fresca e incube durante otra hora o más a temperatura ambiente bajo una agitación suave.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aparato de electroforesis Xcell SureLock Mini-Cell con marcado CE	Invitrogen	EI0001
Fuente de alimentación (modelo 302)	VWR	93000-744
Novex 10% gelatina zymogram gels, 1,0 mm, 12 pocillos	Invitrogen	EC61752BOX
Tampón de carga de gel Blue Juice	Invitrogen	10816015
Consejos de carga de gel	VWR	53509-015
Estándar de peso molecular de proteínas	Invitrogen	LC5800
Tampón de ejecución Novex Tris-Glycine-SDS	Invitrogen	LC2675
Tampón de renaturalización Novex zymogram	Invitrogen	LC2670
Tampón de desarrollo de zimograma Novex	Invitrogen	LC2671
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060