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1. Producción de 15N, 13C-Tau (Figura 1)
- Forma el plásmido de expresión de T7 recombinante pET15b-Tau en células bacterianas de Escherichia coli competentes para BL21(DE3)
NOTA: el ADNc que codifica para la isoforma Tau más larga (441 residuos de aminoácidos) se clona entre los sitios de restricción NcoI y XhoI en el plásmido pET15b.
- Mezcle suavemente 50 μl de células BL21 (DE3) competentes, formando 1-5 x 107 colonias por μg de ADN plasmídico, con 100 ng de ADN plasmídico en un tubo de plástico de 1,5 ml.
nota: Las cepas bacterianas optimizadas para el uso de codones para la expresión de ADNc eucariota no son esenciales para producir Tau humano.
- Coloque la mezcla de células en hielo durante 30 minutos y luego choque térmico durante 10 segundos a 42 °C. Vuelva a colocar el tubo en el hielo durante 5 minutos y agregue 1 ml de medio LB (Luria-Bertani) a temperatura ambiente. Incubar la suspensión bacteriana a 37 °C durante 30 min con una agitación suave.
- Extender usando un asa de inoculación 100 μl de suspensión celular uniformemente sobre una placa de agar de medio LB que contenga 100 μg/ml de antibiótico ampicilina.
- Incubar la placa de selección durante 15 horas a 37 °C.
- Mantener la placa de selección a 4 °C hasta pasar a la etapa de cultivo, durante un máximo de 2 semanas aproximadamente.
NOTA: se puede preparar una reserva de glicerol de cultivo bacteriano (50% de glicerol), almacenada a -80 °C, para iniciar el cultivo en una etapa posterior.
- Añadir 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM complemento vitamínico, 1 ml 100 mg/ml de ampicilina a 1 L de sales M9 esterilizadas en autoclave (6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl).
nota: Se formará un precipitado blanco tras la adición de la solución de CaCl2 a las sales M9 que se disipa rápidamente.
- Solubilizar 300 mg de 15N, 13C-medio completo, 1 g de 15NH4Cl y 2 g de 13C6-glucosa en 10 ml de medio M9. Filtre-esterilice la solución isotópica utilizando un filtro de 0,2 μm, directamente en el medio M9.
- Suspender, mediante un asa de inoculación, una colonia de bacterias transformadas en pET15b-Tau de la placa de selección en 20 ml de medio LB suplementado con 100 μg/ml de ampicilina.
- Incubar el medio inoculado a 37 °C durante unas 6 horas.
- Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600) en 1 ml de una dilución diez veces mayor de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico.
nota: La turbidez del cultivo bacteriano correspondiente a OD600 de 3.0-4.0 indica que se ha alcanzado la fase de crecimiento de saturación.
- Añadir 20 ml del cultivo de LB saturado a 1 L de medio de crecimiento M9 suplementado con ampicilina (concentración final de 100 μg/ml), en un matraz de cultivo con deflector de plástico Erlenmeyer de 2 L.
- Coloque el matraz de cultivo en una incubadora programable ajustada a 10 °C y 50 rpm. Programe la incubadora para que cambie a 200 RPM y 37 °C temprano en la mañana del día siguiente.
- Mida OD600 en 1 ml de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico. Añadir 400 μl de solución madre de IPTG (isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido) (mantenida a -20 °C) cuando la OD600 alcance un valor de aproximadamente 1,0 para inducir la expresión de la proteína Tau recombinante.
- Continúe la incubación a 37 °C durante 3 horas más. Recoja las células bacterianas por centrifugación a 5.000 x g durante 20 minutos.
- Congele el pellet bacteriano a -20 °C. Manténgalo congelado hasta la etapa de purificación, durante un período prolongado si es necesario.
>2. Purificación de 15N, 13C-Tau (Figura 2)
- Tampones de purificación de intercambio catiónico (CEX) en autoclave a 121 °C a menos de 15 psi durante 20 min. Almacene los tampones a 4 °C.
- Descongele el pellet de células bacterianas y vuelva a suspender completamente en 45 ml de tampón de extracción CEX A (50 mM de tampón NaPi pH 6,5, 1 mM EDTA) recién suplementado con cóctel de inhibidores de proteasa 1x (1 comprimido) y DNAseI (2.000 unidades).
- Interrumpa las células bacterianas utilizando un homogeneizador de alta presión a 20.000 psi. Son necesarias 3-4 pasadas. Centrifugar a 20.000 x g durante 40 min para eliminar el material insoluble.
- Calentar el extracto de células bacterianas durante 15 min a 75 °C al baño maría.
NOTA: se observa un precipitado blanco después de unos minutos.
- Centrifugar a 15.000 x g durante 20 min y mantener el sobrenadante que contiene la proteína Tau termoestable.
- Almacenar a -20 °C hasta el siguiente paso de purificación si es necesario.
- Realice la cromatografía de intercambio catiónico en una resina CEX fuerte empaquetada como una columna de lecho de 5 ml utilizando un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) (Figura 3 A).
- Ajuste el caudal a 2,5 ml/min.
- Equilibrar la columna en el búfer CEX A
- Cargue los 60-70 ml de extracto calentado que contienen Tau utilizando una bomba de muestreo o, alternativamente, la bomba A, según el sistema. Recoja el flujo para el análisis para verificar que la proteína Tau se une de manera eficiente a la resina (ver 2.8).
- Lave la resina con tampón CEX A hasta que la absorbancia a 280 nm vuelva al valor de referencia.
- Eluir Tau de la columna utilizando un gradiente de NaCl de tres pasos obtenido por un aumento gradual del tampón CEX B (TAMPÓN CEX A con NaCl 1 M). Programe el FPLC de la siguiente manera: el primer paso del gradiente a un 25% de tampón CEX B en 10 volúmenes de columna (CV) para alcanzar 250 mM de NaCl, el segundo paso a un 50% de tampón CEX B en 5 CV para alcanzar 500 mM de NaCl, y el tercer paso a un 100% de tampón CEX B en 2 CV para alcanzar 1 M de NaCl. Recoja fracciones de 1,5 ml durante las etapas de elución.
- Analice 10 μl de las fracciones recolectadas durante la etapa de elución por SDS-PAGE (12% de SDS-acrilamida en gel) y tinción de Coomassie (Figura 3 A). Compruebe también el paso de carga en la columna analizando 10 μl del flujo de paso.
- Elija las fracciones que contienen Tau y agrupe estas fracciones para el siguiente paso.
- Realice un intercambio de tampones en fracciones agrupadas que contengan Tau (Figura 3 B).
- Equilibrar una columna desalinizadora de 53 ml de lecho empaquetado con resina G25 (26 x 10 cm) en bicarbonato amónico (tampón volátil) 50 mM utilizando un sistema FPLC.
- Ajuste el caudal a 5 ml/min. Inyecte la muestra de Tau en la columna a través de un asa de inyección de 5 ml. Recoja las fracciones correspondientes al pico de absorción a 280 nm.
- Repita la inyección 3-4 veces, dependiendo del volumen de la piscina CEX inicial.
- Calcule la cantidad de proteína Tau purificada utilizando el área máxima del cromatograma a 280 nm (1 mg de Tau corresponde a 140 mAU*ml).
nota: El coeficiente de extinción de la proteína Tau a 280 nm es de 7.550 M-1 cm-1. Tau no contiene ningún residuo de Trp.
- Agrupa todas las fracciones de Tau.
- Alícuota de la muestra en tubos que contengan el equivalente de 1 a 5 mg de Tau. Elija estos tubos de modo que el volumen de solución sea pequeño en comparación con el volumen del tubo (por ejemplo, 5 ml de solución en un tubo de 50 ml).
- Haz agujeros en las tapas de los tubos con una aguja. Congele las muestras de Tau a -80 °C.
- Liofilizar muestras de Tau. La proteína Tau liofilizada puede mantenerse a -20 °C durante largos períodos de tiempo.
>3. Fosforilación in vitro de 15N-Tau
- Disolver 5 mg de Tau liofilizado en 500 μl de tampón de fosforilación (50 mM Hepes·KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
- Añadir 2,5 mM de ATP (25 μl de 100 mM de solución madre mantenida a -20 °C), 1 mM de DTT (1 μl de 1 M de solución madre mantenida a -20 °C), 1 mM de EGTA (2 μl de una solución madre de 0,5 M), 1x cóctel de inhibidores de la proteasa (25 μl de un stock 40x obtenido disolviendo 1 comprimido en 1 ml de tampón de fosforilación) y 1 μM de His-ERK2 activado (250 μl en tampón de conservación 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl y 10% glicerol, almacenado a -80 °C) en un volumen total de muestra de 1 ml.
nota: El His-ERK2 activado se puede preparar internamente mediante fosforilación con la quinasa MEK.
- Incubar 3 horas a 37 °C.
- Calentar la muestra a 75 °C durante 15 min para inactivar la quinasa ERK.
- Centrifugar a 20.000 x g durante 15 min. Recoger y conservar el sobrenadante.
- Desalar la muestra de proteína en bicarbonato de amonio 50 mM utilizando una columna de 3,45 ml de lecho empaquetado en resina G25 (1,3 x 2,6 cm), que es adecuado para una muestra de 1 ml.
- Ejecute una SDS-PAGE al 12% con 2,5 μl de la muestra de proteína para comprobar tanto su integridad como su fosforilación eficiente (Figura 4).
- Liofilizar la muestra de Tau fosforilada. Almacene el polvo a -20 °C.
>4. Adquisición de espectros de RMN (Figura 5)
- Solubilizar 4 mg de 15N, 13C ERK-Tau fosforilado liofilizado en 400 μl de tampón de RMN (50 mM de NaPi o 50 mM de Tris-d11 deuterado. Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA y 1 mM DTT).
- Agregue 5% D2O para el bloqueo de campo del espectrómetro de RMN y 1 mM TMSP (3-(trimetilsilil)propiónico-2,2,3,3-d4 sal sódica ácida)) como referencia de señal de RMN interna. Añadir 10 μl de una solución madre 40x de un cóctel completo de inhibidores de la proteasa.
- Transfiera la muestra a un tubo de RMN de 5 mm utilizando una jeringa electrónica con una aguja larga o una pipeta Pasteur. Cierre el tubo de RMN con el émbolo. Elimine las burbujas de aire atrapadas entre el émbolo y el líquido por los movimientos del émbolo.
- Coloque el tubo de RMN en una ruleta. Ajuste su posición vertical en el spinner con el calibre apropiado para la cabeza de la sonda de RMN utilizada, de modo que la mayor parte de la solución de muestra esté dentro de la bobina de RMN.
- Inicie el flujo de aire: haga clic en levantar en la ventana del sistema de control de imanes. Coloque con cuidado el spinner con el tubo en el flujo de aire en la parte superior del orificio del imán. Detenga el flujo de aire (elevación de clic) y deje que el tubo descienda a su lugar dentro de la cabeza de la sonda en el imán.
- Ajuste la temperatura a 25 °C (298 K).
- Realice el ajuste semiautomático y la adaptación del cabezal de la sonda para optimizar la transmisión de potencia. Escriba atmm en la línea de comandos.
- Bloquee la frecuencia del espectrómetro utilizando la señal D2O de la muestra registrada en el canal de deuterio. Haga clic en bloquear en la ventana del sistema de control de imanes.
- Inicie el procedimiento de calce para optimizar la homogeneidad del campo magnético en la posición de la muestra. Escriba topshim gui en la línea de comandos para abrir la ventana de corrección. Haga clic en Iniciar en la ventana de corrección. Compruebe el valor de variación estándar B0 residual para verificar que las cuñas sean óptimas (menos de 2 Hz es bueno).
- Calibrar el parámetro p1 (longitud de un pulso de radiofrecuencia de protones en μseg), que es necesario para obtener una rotación de 90° de los espines de protones. Apunte al pulso de 360° utilizando un espectro 1D de protones de agua (Figura 6).
- Ajuste el desplazamiento de frecuencia ajustando el parámetro o1 (en Hz) a la frecuencia del agua de protones en el espectro 1D (Figura 6).
- Inicie la adquisición de un espectro de protones 1D (secuencia de pulsos con secuencia de watergate para la supresión de señales de agua, por ejemplo, zggpw5) para verificar las señales de la muestra (Figura 7). Adapte el número de exploraciones a la concentración relativa de proteínas. Escriba zg en la línea de comandos para iniciar la adquisición.
