1. Concentración de trabajo de los componentes de la reacción
- Prepare las concentraciones de trabajo de los tampones para CD en fresco y manténgalas a 4 °C antes de configurar las reacciones.
nota: Para las reacciones de CD descritas en este documento, las concentraciones de trabajo de los componentes son las siguientes: Tampón de fosfato de sodio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, ADN 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
>2. Elección y preparación de cubetas de CD
- Recoge espectros de CD en cubetas de cuarzo de alta transparencia. Utilice cubetas rectangulares o cilíndricas.
nota: Se utilizó una cubeta de cuarzo CD (volumen nominal de 0,4 mL, longitud del camino de 1 mm) para todas las reacciones descritas en este trabajo.
- Use una solución de limpieza de cubetas para limpiar la cubeta. Añadir un 1% de solución limpiadora de cubetas en agua para hacer 400 μL de la solución, verterla en la cubeta e incubarla a 37 °C durante 1 h.
- Lave la cubeta con agua varias veces para limpiarla. Tome un escaneo del agua o del tampón en la cubeta para verificar si está limpia.
nota: El agua o el tampón deben dar una lectura en el rango de 0 a 1 mdeg.
>3. Preparación de proteínas y oligonucleótidos de ADN
- Mantenga el volumen de la proteína por debajo de 50 μL en la reacción para minimizar las cantidades de los componentes tampón que a veces causan la formación de picos ambiguos. Mantenga la proteína en el hielo durante todo el experimento para evitar cualquier degradación.
- Utilice oligonucleótidos de ADN purificados con PAGE en las reacciones.
nota: En las reacciones descritas aquí, el ADN se utilizó tanto en formas nativas como en formas enfriadas por calor (enfriamiento rápido (FC) y enfriamiento lento (SC)). El enfriamiento rápido promueve la unión intramolecular en el ADN, produciendo más estructuras secundarias. Por el contrario, el enfriamiento lento promueve la unión intermolecular en el ADN, lo que resulta en menos estructuras secundarias.
- Para un enfriamiento rápido, caliente DNA a 94 °C durante 3 min en el bloque calefactor y enfríelo inmediatamente con hielo. Para un enfriamiento lento, caliente el ADN a 94 °C durante 3 minutos y deje que se enfríe a temperatura ambiente a una velocidad de 1 °C por minuto.
>4. Configuración de experimentos de control para registrar los espectros de referencia
- Mantenga el volumen de reacción a 300 μL en todas las reacciones. Configure un total de 5 reacciones de referencia en tubos de centrífuga de 1,5 mL, una por una, de la siguiente manera: i) Tampón + Agua; ii) Tampón + MgCl2 + ATP + Agua; iii) Tampón + MgCl2 + ATP + Proteína + Agua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampón + Proteína + Agua.
>5. Configurando los experimentos para grabar espectros de CD
- Configure un total de 5 reacciones, una por una, en tubos de centrífuga de 1,5 ml de la siguiente manera: i) Tampón + ADN + Agua; ii) Tampón + ADN + MgCl2 + ATP + Agua; iii) Tampón + ADN + MgCl2 + ATP + Proteína + Agua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampón + ADN + Proteína + Agua.
>6. Escaneo de grabación
- Abra el gas y encienda el espectrómetro de CD.
- Encienda la lámpara después de 10-15 min. Encienda el baño de agua y ajuste la temperatura del soporte a 37 °C.
- Abra el software CD Spectrum.
- Ajuste la temperatura a 37 °C.
- Establezca el rango de longitud de onda en 180 - 300 nm.
- Establezca el tiempo por punto en 0,5 s.
- Establezca el número de escaneo en 5.
- Haga clic en Pro-Data Viewer, cree un nuevo archivo y cámbiele el nombre con detalles sobre el experimento y la fecha.
- Mantenga todos los componentes de la reacción en hielo para evitar cualquier degradación. Hacer las líneas de base y las reacciones, una por una, en tubos de centrífuga y mezclarlas mediante pipeteo. Transfiera la mezcla de reacción a la cubeta con cuidado, asegurándose de que no haya burbujas de aire.
- Si se realiza un experimento de curso temporal, incube las reacciones a 37 °C durante el tiempo requerido y realice la exploración. Agregue EDTA al tampón que contiene el ADN, ATP, Mg+2 y proteínas para detener la hidrólisis de ATP.
- Aumentar la concentración de EDTA y su tiempo de incubación para inhibir completamente la actividad de la ATPasa.
- Reste las líneas de base de las reacciones correspondientes en el software (por ejemplo, reste la reacción 1 de la línea de base 1). Suaviza los datos en el software de espectro de CD o en el software de trazado de datos. Trace los datos en el software de trazado de datos.
nota: Al restar las líneas de base de las reacciones correspondientes, se obtendrán los espectros CD netos de solo ADN.
>7. Análisis e interpretación de datos
- Utilice la fórmula dada por la ec (1) para convertir los valores obtenidos en miligrados en elipticidad media del residuo.
Aquí, S es la señal CD en miligrados, c es la concentración de ADN en mg/mL, mRw es la masa media del residuo y l es la longitud del camino en cm.
- Traza un gráfico en función de la longitud de onda y la elipticidad media de los residuos utilizando el software de trazado de datos y analiza los picos.
- Para trazar el gráfico, seleccione la elipticidad media del residuo en el eje Y y la longitud de onda en el eje X y trace un gráfico en línea recta.
nota: Este gráfico proporcionará los picos característicos de las diferentes formas de ADN. Las formas de ADN correspondientes a los picos se pueden identificar utilizando la literatura existente.