$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Preparar sondas UV-Vis/Raman
- Preparación de la solución desnuda de AuNP
- Prepare una solución de 2 ml de AuNPs con una concentración de aproximadamente 1 x 1011 partículas por ml.
- Si es necesario concentrar las AuNPs, llene los tubos de centrífuga de baja unión con 2.000 μl de AuNP en stock y centrifugue a 5.000 x g durante 20 min o hasta que el sobrenadante esté claro. Retire el sobrenadante pipeteando, teniendo cuidado de no alterar el pellet de AuNP.
- Combine las soluciones restantes de AuNP en un tubo y estime la concentración obteniendo una medición UV-Vis y comparando los valores con las concentraciones conocidas, ya que se trata de una relación lineal.
- Determine la proporción de etiquetado Raman Reporter adecuada
- Prepare una solución de trabajo del reportero Raman disuelto en metanol. Esta concentración dependerá del reportero utilizado. En este trabajo, prepare yoduro de 3,3′-dietiltiatricarbocianina (DTTC) en una solución de trabajo de 200 μM.
- Suponiendo un volumen final de 100 μl para cada pocillo, agregue suficiente cantidad de la solución reportera de trabajo a cada pocillo de la primera fila de una placa de 96 pocillos, de modo que el reportero Raman oscile en concentraciones de 0,2 μM a 10 μM. Agregue suficiente agua de grado HPLC a cada pocillo de modo que el volumen sea de 80 μl. Agregue 20 μl de AuNP a cada pocillo para obtener un volumen final de 100 μl por cada pocillo. En la Tabla 1 se proporciona un ejemplo.
- Mida los espectros UV-Vis de 400 a 700 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de lectura de placas. La concentración adecuada es la concentración más alta con picos definidos para los espectros UV-Vis. Repita el paso 2.2.2 a concentraciones crecientes hasta que se encuentre la relación de concentración más alta de reporteros Raman a AuNPs.
nota: El colorante y la forma, el tamaño y el fabricante de AuNP influyen en la concentración adecuada. Por lo tanto, los pasos enumerados deben evaluarse y modificarse en función de los componentes utilizados. Este protocolo implicaba el uso de un tinte cargado positivamente. Como tal, la unión entre el AuNP y el informante se mejoró mediante el uso de AuNP cargados negativamente. Esto se hizo mediante el uso de AuNP con citrato. Consulte la sección Discusión para obtener más detalles.
- Enlace de reportero Raman y PEG-Ab a AuNP
- Prepare dos lotes de 1,5 ml de AuNP y Raman reportero a la concentración previamente determinada, permitiendo que el reportero Raman se una a los AuNP durante 30 min a temperatura ambiente.
- Agregue el anticuerpo pegilado (PEG-Ab) a un lote de la solución reportera de AuNP y Raman para crear una proporción de 200:1 de anticuerpos a partículas. Esta solución será para las muestras de prueba. En un tubo de microcentrífuga separado, agregue el antígeno pegilado al otro lote de la solución reportera de AuNP y Raman en una proporción de 200:1 de anticuerpo a partículas que se utilizará como control. Incubar las soluciones durante 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: La proporción de anticuerpos con respecto a las partículas será específica de las AuNPs y del colorante utilizado y debe optimizarse para cada caso individual. El objetivo aquí es tener la proporción más alta de anticuerpos para que las sondas AuNP se unan y evitar la agregación de las partículas. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados para sumar:
donde V es el volumen y C es la concentración expresada en partículas o anticuerpos por ml. El volumen final debe ser de aproximadamente 1,5 ml.
- Bloquee los sitios restantes en la superficie de AuNP con mPEG-SH.
- Prepare mPEG-SH disolviendo tiol sólido de metoxipolietilenglicol a una concentración de 200 μM con agua. Agite la solución hasta que mPEG-SH se disuelva por completo.
- Agregue mPEG-SH en una proporción de 40,000:1 a la solución AuNP-PEG-Ab hecha en el paso 2.3. Incube la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos para asegurarse de que los sitios restantes en la nanopartícula de oro estén bloqueados. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados para sumar:
donde V es el volumen y C es la concentración expresada en partículas o anticuerpos por ml. El volumen final debe ser de aproximadamente 1,5 ml.
- Recupere sondas Raman funcionalizadas.
- Centrifugar partículas a 5.000 x g durante 20 min en tubos de centrífuga de baja unión o hasta que el sobrenadante esté claro. Retire el sobrenadante pipeteando, teniendo cuidado de no alterar las AuNPs.
- Vuelva a suspender las partículas con 1 ml de 1x solución de PBS que se hizo anteriormente. Estime la concentración de AuNP tomando una medición UV-Vis de un pequeño volumen de solución (3 μl) y compare los resultados con las mediciones de una concentración de AuNP conocida. Ajuste el volumen de modo que la solución final sea de al menos 1 x 1011 partículas por ml.
- Almacene las soluciones a 4 °C hasta que se utilicen para funcionalizar la placa de inmunoensayo. Utilice las soluciones en el plazo de una semana.
Tabla 1. Ejemplo de dilución DTTC. Varias diluciones de DTTC y los volúmenes asociados de DTTC en stock, solución de nanopartículas de oro y agua.
| Volúmenes a añadir de cada componente (ml) |
| Concentración final DTTC (mM) | Solución de trabajo DTTC (200 mM) | AuNP | Agua |
| 0.2 | 0.1 | 20 | 79.9 |
| 0.6 | 0.3 | 20 | 79.7 |
| 1 | 0.5 | 20 | 79.5 |
| número arábigo | 1.0 | 20 | Artículo 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77.5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76.5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
>2. Preparación de la placa de inmunoensayo
- Unir el antígeno deseado a la placa de inmunoensayo.
- Prepare suficientes antígenos diluidos (50 μg/ml) para llenar los pocillos de poliestireno. Agite la solución en vórtice e inmediatamente agregue la solución a los pocillos de placa. Deje que el antígeno se una a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lave los antígenos no unidos.
- Retire el exceso de solución de antígeno vertiendo la solución en un recipiente de desecho y golpeando el plato contra una mesa cubierta con toallas de papel.
- Agregue TBST a los pocillos para lavar la superficie, luego retire el lavado de la misma manera que se indicó anteriormente. Repita este paso dos veces más.
- Bloquee los sitios de unión restantes en la placa para evitar uniones no específicas.
- Agregue 70 μl de solución de bloqueo de HSA a cada pocillo de la placa e incube a temperatura ambiente durante 30 min.
- Retire y enjuague la placa utilizando el mismo procedimiento especificado en el paso 3.2. Cubra la placa y guárdela en seco a 4 °C hasta que esté lista para su uso posterior.
- Funcionalizar la placa de inmunoensayo.
- Añada 70 μl de las nanopartículas de sonda preparadas en la sección 2 a la primera columna de una placa de 96 pocillos y diluya las columnas siguientes utilizando una dilución en serie 1:2. Deje que la placa se incube durante al menos 1 hora. En la Figura 1 se muestra un ejemplo de cómo preparar la placa de inmunoensayo.
- Lave la placa con TBST cinco veces como se detalla en el paso 3.2, asegurándose de desechar los AuNP de manera adecuada. Después del lavado final, agregue 70 μl de 1x PBS a cada pocillo y cúbralo con un sello de placa.
NOTA: Las muestras de control deben ser claras. Si se ha producido la unión no específica, las muestras de control tendrán un color similar al de las muestras de prueba.
- Pruebe la sensibilidad del ensayo mediante espectroscopía UV-Vis y Raman.
- Para cada pocillo, mida los espectros UV-Vis que van de 400 a 700 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de lectura de placas.
- Usando un microscopio Raman invertido, enfoque el objetivo en la superficie del pozo que tiene las sondas AuNP. Obtén espectros Raman del pozo. Recoge un espectro que va desde los 1.800 cm-1 hasta los 400 cm-1. Repita este paso para todos los pozos.
- Utilizando el software espectral adecuado, realice una corrección de línea base polinómica de11º orden para los espectros Raman y un polinomio de3º orden para los espectros UV-Vis.
- Utilizando el software espectral adecuado, normalice los espectros Raman y UV-Vis. Establezca el valor máximo en 1 y escale todos los demás valores en consecuencia. Para normalizar los espectros Raman, seleccione un pico de poliestireno único y establézcalo igual a 1, y escale todos los demás valores en consecuencia.
- Utilizando el software espectral adecuado, realice la integración de picos para cada espectro. Para los espectros Raman, el pico que representa el reportero Raman debe estar en una región ausente de picos de poliestireno. Para realizar la integración de picos, especifique los límites integrales para el pico deseado y registre el área de pico deseada para todas las muestras, incluidos los controles.
- Represente gráficamente el área de interés del pico medio en función del logaritmo de la concentración de AuNP con barras de error para cada punto que indiquen su desviación estándar asociada. Ajuste estos puntos de calibración a una curva logística de 4 parámetros.
- Determine el valor medio de la pieza en blanco promediando el área del pico de interés para una muestra en blanco. Determine la desviación estándar de estas áreas; Esta es la desviación estándar del espacio en blanco.
- Para el mismo pico analizado en el paso anterior, encuentre la desviación estándar de esa área de pico para la concentración más baja.
- Calcule el límite del espacio en blanco y el límite inferior de detección como se especifica en la sección Resultados representativos. Utilice estos valores con las curvas de calibración 4PL para determinar el LLOD en términos de concentración de AuNP.
