Construcción de un modelo de ratón humanizado con inmunidad modificada contra el VIH

Abstract

Fuente: Zhen, A., et al. Inmunidad modificada basada en células madre contra la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado. J. Vis. Exp. (2016).

El video muestra una técnica para generar un modelo de ratón humanizado con inmunidad de ingeniería basada en células madre contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). El tejido del timo fetal humano y las células madre hematopoyéticas (HSC) modificadas genéticamente se implantan en la cápsula renal de un ratón gravemente inmunodeprimido. Las HSC, que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) contra el VIH, se mezclan en una mezcla de proteínas gelatinosas que promueve su colocalización con el tejido del timo. Después del procedimiento, las HSC se diferencian en varias células inmunitarias humanas, lo que da como resultado el desarrollo de un modelo de ratón humanizado con un sistema inmunitario humano funcional contra el VIH.

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto. Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Construcción de ratones humanizados modificados con receptor de antígeno quimérico CD4

1. Procesamiento del timo fetal y aislamiento de HSC CD34+ del hígado fetal
   1. Procesamiento del timo
      1. Lavar suavemente el timo en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, en un tubo cónico de 15 ml. Repita el paso de lavado 3 o 4 veces.
      2. Añadir 7 ml de medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% de suero fetal bovino (FBS) + penicilina/estreptomicina (Pen/estreptococo). Decanta todo en una placa de Petri estéril de 100 mm.
      3. Use bisturíes para cortar el timo en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm². Coloque cada pieza de timo en un solo pocillo en un plato de 96 pocillos. Use pinzas romas curvas cuando transfiera las piezas de timo a la placa de 96 pocillos.
         1. Agregue una pequeña cantidad de medio (100 - 200 μl) a todos los pocillos para que el tejido no se seque. Visualice bajo un microscopio (los tímies tienen lóbulos y deben verse como sacos de células).
            nota: Deseche cualquier pieza que parezca cuestionable de alguna manera; A menudo hay tejido conectivo, y este no debe ser implantado.
      4. Retire los trozos de timo confirmados y colóquelos todos en un matraz de cultivo celular T25. Añadir 7 ml de medios RPMI suplementados con un 10% de FBS y 450 μg/ml de piperacilina/tazobactam y anfotericina B. Matraz de roca suave para mezclar. Cultivar el matraz durante la noche a 37 ºC/5% CO₂.
         nota: Este paso es necesario para evitar la contaminación bacteriana del tejido.
      5. (Paso opcional) Congele el timo para usarlo en el futuro. Equilibra los trozos en 90% Human AB Serum con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) durante 10 min. Congelarlos a 1 ºC/min a -50 ºC, luego enfriar rápidamente a -150 ºC. Cuando esté listo para descongelar, descongele rápidamente en un baño de agua a 37 ºC y lave suavemente 3 veces en medios completos RPMI sin DMSO.
   2. Procesamiento del hígado
      1. Lave suavemente el hígado en PBS en un tubo cónico de 50 ml. Repita el paso de lavado 3 o 4 veces.
      2. Añadir 10 ml de Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) al tubo cónico de 50 ml. Decantar todo en una placa de Petri estéril de 100 mm.
      3. Homogeneizar el tejido hepático con dos bisturís. Cortar el hígado en trozos pequeños de unos 3^mm2. Corta y desecha cualquier tejido conectivo blanco.
      4. Utilice una jeringa de 10 ml provista de una aguja roma de calibre 16 para absorber los trozos de hígado y los medios. A continuación, transfiéralo a un tubo cónico de 50 ml.
      5. Vuelva a suspender el medio y la suspensión del tejido y expulse 5-7 veces más para homogeneizar el tejido por completo.
      6. Prepare 10 ml de medios IMDM suplementados con enzimas: 500 U/ml de colagenasa, 2.400 U/ml de hialuronidasa y 300 U/ml de DNasa, así como 450 μg/ml de piperacilina/tazobactam y anfotericina B. Filtre el medio a través de un filtro de 0,22 μm y luego agregue el medio a la suspensión hepática.
      7. Tape el tubo cónico de 50 ml que contiene la suspensión hepática y selle herméticamente con una película autosellante como Parafilm para evitar fugas. Rotar en un tubo rotador en la incubadora a 37 ºC durante 90 min.
      8. Filtre la suspensión celular digerida a través de un colador celular de 100 μm en un tubo nuevo de 50 ml.
         nota: Agregue PBS a la suspensión para aumentar el volumen total a 50 ml. Divídelo en dos tubos de 50 ml, cada uno de los cuales contiene 25 ml de suspensión celular.
      9. Frote lenta y suavemente las células de cada tubo con un medio de centrifugación de densidad de 10 ml (por ejemplo, Ficoll). Centrifugar a 1.200 x g durante 20 min sin freno. Nota: todas las centrifugaciones mencionadas en este protocolo se realizan a temperatura ambiente (25 ºC).
      10. Retire con cuidado la interfaz (es decir, la capa leucocitaria) de cada tubo y transfiéralo a dos tubos separados de 50 ml. Lleve el volumen de cada tubo de interfaz hasta 50 ml con PBS. Girar a 300 x g durante 7 - 10 min. Aspire el sobrenadante con cuidado.
      11. Combine los dos pellets. Lavar tres veces más con 50 ml de PBS que contienen un 2% de FBS. Girar a 300 x g durante 7 - 10 min cada uno mientras se aspira cuidadosamente el sobrenadante.
      12. Vuelva a suspender el pellet en 50 ml de medio RPMI + 10% FBS. Cuente las células con un hemocitómetro antes de proceder a la clasificación de células.
      13. De acuerdo con el protocolo del fabricante, clasifique las células CD34+ inmediatamente utilizando un kit de clasificación de CD34 (por ejemplo, microperlas de CD34).
          nota: Alternativamente, las células se pueden cultivar durante la noche en medios RPMI + 10% FBS a 1 millón/ml.
      14. Guarde las fracciones CD34+ y CD34-.
          nota: En este paso, las células CD34+ y CD34- se pueden congelar utilizando medios de congelación Bambanker u otros medios de congelación. Congele 1 ml de 4 - 6 x 10^{6 células} CD34+ por tubo y congele 1 ml de 40 - 60 x 10⁶ células CD34- por tubo.
2. Transducción de células CD34+
   1. Calcule el número de pocillos de transducción necesarios para una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos. Un pocillo se puede utilizar para transducir hasta 8 x 10⁶ células. Por cada ratón de médula ósea/hígado/timo (BLT), se implantarán 0,5 x 10⁶ células CD34+ junto con células CD34- y timo debajo de la cápsula renal, y 0,5 x 10^{6 células} CD34+ se inyectarán por vía intravenosa. El número de células CD34+ que se van a utilizar viene determinado por el número de ratones (1 millón de células por ratón).
   2. Cubra el número necesario de pocillos de 6 pocillos tratados con cultivo de tejidos con 1,25 ml de solución recombinante de fibronectina humana (por ejemplo, retronectina) (20 μg/ml en PBS) en cada pocillo. Cubra la placa y déjela reposar durante 2 horas a temperatura ambiente en un gabinete de bioseguridad limpio.
   3. Aspire la solución de fibronectina de los pocillos y agregue 1,25 ml de tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (PBS con 4% de FBS) a cada pocillo para bloquear. Deje reposar la placa a temperatura ambiente (25 ºC) durante 30 min.
   4. Aspire el tampón FACS y lave los pozos una vez con PBS.
   5. Mantenga el PBS en los pocillos recubiertos hasta que la placa esté lista para su uso. Guarde la placa a 4 ºC durante la noche si no se utiliza inmediatamente.
   6. Placa las células CD34+ en el medio de infección (2% de albúmina sérica humana en el medio de células T sin suero de Yssel) en pocillos recubiertos con solución de fibronectina (~2 x 10⁶ células/ml) e incubar a 37 ºC durante 1 hora.
   7. Utilice una pipeta para añadir vectores lentivirales a los pocillos con una multiplicidad de infección (MOI) entre 2 y 10. Mezclar suavemente e incubar durante la noche a 37 ºC.
      nota: El título del vector lentivirus utilizado debe determinarse de antemano.
   8. Coseche las celdas al día siguiente raspando suavemente el fondo de los pozos con un raspador de celdas. Recoja las células y cuéntelas con un hemocitómetro.
   9. Para preparar las células para el implante, combine 0,5 x 10^{6 células} CD34+ transducidas con 4,5 x 10^{6 células} CD34- por ratón, alícuotas en tubos estériles de 1,5 ml con tapón de rosca. Gire las células a 300 x g hasta el pellet y aspire el sobrenadante. Vuelva a girarlos a 300 x g, aspire el sobrenadante restante con una pipeta P10 y aspire con mucho cuidado. Mantenga los gránulos secos en hielo durante todo el estudio. nota: Para asegurarse de que las células sean viables, utilice las células peletizadas y realice la cirugía en un plazo de 2 a 3 horas.
   10. Para preparar las células para la inyección, centrifugar 0,5 x 10^{6 células} CD34+ transducidas por ratón para pellets y aspirar el sobrenadante. Resuspenda las células en medios de 100 μl RPMI por ratón y manténgalas en hielo.
   11. Para verificar la eficiencia de la transducción, alícuota ~ 1 x 10⁵ células CD34+ transducidas y no transducidas de cada condición y cultivo en medio de citocinas de 200 μl (medio RPMI con 10% de FBS, suplementado con 100 ng/ml de IL-3, IL-6, SCF humana) en placa de 96 pocillos durante 5 a 7 días a 37 ºC.
       nota: Las células utilizadas en este paso no se utilizan para la cirugía, sino para garantizar que la transducción sea exitosa y que el vector no sea tóxico para la supervivencia y renovación de las células madre. La eficiencia de la transducción puede comprobarse buscando la expresión génica del vector (por ejemplo, GFP y CD4) y analizarse mediante citometría de flujo.
3. Trasplantes de tejidos para construir ratones modificados genéticamente
   1. El mismo día antes de la cirugía, se realiza la irradiación corporal total del NOD. Ratones inmunocomprometidos Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) con un irradiador de cesio-137 y una dosis de 2,7 Gy (270Rad).
      nota: Los ratones NSG están gravemente inmunocomprometidos. Por lo tanto, su alojamiento y mantenimiento deben cumplir con los más altos estándares de salud y ser manejados por personal altamente capacitado.
   2. Vierta los trozos de timo y el medio del matraz en un plato de 60 mm. Vierta PBS en otro plato de 60 mm, que se utilizará para limpiar el trochar y mantener el riñón húmedo.
   3. Enfríe las puntas de pipeta de desplazamiento positivo colocándolas en tubos estériles abiertos de 1,5 ml con tapón de rosca sobre hielo. Mantener en hielo con los gránulos de células secas y la mezcla de proteínas gelatinosas como Matrigel.
      nota: Es importante mantener fría la mezcla de proteínas gelatinosa y los tubos o puntas que puedan tocarla hasta que se cargue la aguja del implante.
   4. Anestesiar a los ratones: Pesar a los ratones individualmente y registrar los pesos; golpear la oreja de los ratones para numerarlos. Inyectarles por vía intraperitoneal 15 μl de Ketamina (2,6 mg/ml en solución salina)/Xilacina (100 mg/ml en solución salina) por gramo de peso corporal). Vuelva a colocar a los ratones en la jaula y espere a que estén completamente anestesiados.
      nota: Compruebe el nivel de anestesia del ratón apretando una pata. Si el ratón se estremece por reflejo, administre el 25-50% de la cantidad original de ketamina/xilacina para anestesiar aún más al ratón. Espere hasta que no se estremezca por reflejo para realizar la cirugía.
   5. Con la maquinilla Oster (afeitadora), afeita el lado izquierdo de cada ratón desde la cadera hasta el hombro entre el centro de la espalda y el estómago. Inyectar por vía subcutánea 0,3 ml de carprofeno diluido (6 mg/kg) en el hombro o en el triángulo inguinal del animal (fosa de la pierna). Con un hisopo de algodón, coloque una pequeña gota de lágrimas artificiales en cada ojo y coloque al ratón de costado en la jaula><. nota: Limite la preparación para la cirugía a una jaula (aproximadamente 4 a 5 ratones) a la vez.
   6. Enjuague la cánula de la aguja de implante oncológico de calibre 16 (trócar) con PBS. Con un par de pinzas curvas romas, coloque un trozo de timo del plato de 60 mm en la abertura de la cánula con el trócar justo dentro de la abertura, luego tire del trócar hacia atrás para aspirar el tejido en la cánula.
   7. Utilice una pipeta de desplazamiento positivo y una punta refrigerada para introducir 5 μl de mezcla de proteínas gelatinosa fría en el tubo con un pellet de células secas (mezcla de CD34+ y CD34 para células implantadas) y agite suavemente para generar una suspensión celular. No pipetee hacia arriba y hacia abajo. Pipetee la mezcla gelatinosa de proteínas / suspensión celular en la abertura de la cánula y tire lentamente hacia atrás del trócar para cargar la aguja.
      nota: Se recomienda tener un ayudante para cargar la pipeta mientras se manipula la aguja del implante.
   8. Frote el área afeitada del ratón con povidona yodada y posteriormente limpie el área con una toallita con alcohol tres veces. Determina la mancha más oscura debajo de la piel. Esto indica la ubicación del bazo. El riñón mide aproximadamente 5 mm dorsal al bazo. Levante la piel con pinzas curvas y haga una incisión de 15 mm de largo con tijeras quirúrgicas en la piel paralela al bazo. Luego, haz un corte similar en la capa del peritoneo que se encuentra debajo. En los hombres, el riñón debe ser fácilmente visible y puede extruirse simplemente presionando el abdomen. Puede sostener el riñón con un hemostático o pinzas romas curvas. En las mujeres, los ovarios tienden a bloquear el riñón para que no sea fácil de extraer. Con un hemostático, levante el ovario y exponga cuidadosamente el riñón.
   9. Use las pinzas con punta de aguja para hacer un pequeño orificio en el extremo posterior de la cápsula renal.
      nota: No utilice estas pinzas con punta de aguja para manipular materiales de riesgo biológico.
   10. Deslice la aguja del implante en este orificio y a lo largo del riñón hasta que la abertura de la cánula quede completamente cubierta por la cápsula renal.
   11. Extruya suavemente el tejido debajo de la cápsula renal y tire de la aguja hacia afuera. Las piezas de timo pueden ser pegajosas, así que use pinzas curvas para asegurarse de que la pieza de timo no se salga con la aguja.
   12. Levante el peritoneo con las pinzas y use suavemente el hemostático para empujar el riñón de nuevo a su lugar. Ata un punto de doble nudo en el peritoneo con suturas reabsorbibles de vicryl 4-0. Utilice dos pinzas para heridas Autoclips para cerrar la piel.
   13. Mezcle las células CD34+ transducidas reservadas para inyección y absorba 100 μl (0,5x10⁶ células) en una jeringa de insulina. Inyectar estas células en el ratón a través de una inyección en la vena retroorbitaria u otras vías de inyección intravenosa. Con un hisopo de algodón, coloque una pequeña gota de lágrimas artificiales en cada ojo y acueste al ratón de costado en una jaula.
   14. Una vez que todos los ratones hayan sido implantados, confirme que los animales están recuperando la conciencia y deambulan normalmente antes de abandonarlos.
   15. Cuidados postoperatorios: Inyectar por vía subcutánea 0,3 ml de Carprofeno diluido (6 mg/kg) y 1,2 ml de suero fisiológico estéril en cada ratón al día siguiente de la cirugía. 2 y 3 días después de la cirugía, inyectar por vía subcutánea 1,5 ml de solución salina estéril en cada ratón. Monitoree los ratones y las incisiones durante 10-14 días después de la cirugía. Retire los Autoclips y pese los ratones después de 10-14 días. nota: Los ratones son lentos después de la radiación, y la inyección de solución salina evita que los animales se deshidraten.
   16. Después de 8 a 10 semanas, verifique el injerto sangrando los ratones y realizando un análisis FACS en la sangre periférica, tiñendo marcadores como CD45, CD3, CD4, CD8 y cualquier gen que el vector deba expresar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de microperlas CD34	miltenyi	130-046-702	Para la clasificación de células progenitoras CD34+ humanas
Bambanker	Wako	302-14681	para congelar células
Kit de ARN viral QIAamp	Qiagen	52904	Para medir la carga viral en el suero
MACSQutómetro de flujo	Miltenyi		Para el análisis de caudal
BD LSRFortessa™	BD biociencias		Para el análisis de caudal
hialuronidasa	sigma	H6254-500MG	Para la digestión de tejidos
Desoxirribonucleasa I	Worthington	LS002006	para la digestión de tejidos
colagenasa	Tecnología de vida	17104-019	para la digestión de tejidos
Sistema de detección PCR en tiempo real CFX	Biorad		Para medir la carga viral y la expresión génica
Ratones, cepa NOD. Cg-Prkdcscid il2rgtm1Wjl/SzJ	El Laboratorio Jackson	5557	Para la construcción de los ratones humanizados
Penicilina Estreptomicina (estreptococo en pluma)	Thermo Fisher Scientific	10378016	Para el cultivo de células
piperacilina/tazobactam	Pfizer	Zosyn	Antifúngico
Anfotericina B (Fungizone antimicótico)	Thermo Fisher Scientific	15290-018	Antifúngico
AUTOCLIP Pinzas para heridas, 9 mm - 1000 unidades	Becton Dickinson	427631	Para la cirugía
Batas quirúrgicas estériles Aurora reforzadas con polietileno, 30 por caja	Medline	DYNJP2707	Para la cirugía
Suturas, 4-0, vicryl	Owens y Minor	23000J304H	Para la cirugía
Almohadillas de preparación para bebidas alcohólicas	Owens y Minor	3583006818	Para la cirugía
Guantes, quirúrgicos, 6 1/2	Owens y Minor	4075711102	Para la cirugía
Medio de células T sin suero de Yssel	Bioproductos Gemini	400-102	Para la transducción de células CD34+
Albúmina sérica humana	Sigma-Aldrich	A9511	Para la transducción de células CD34+