Una técnica de espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier para estudiar el autoensamblaje de péptidos

Resumen

Fuente: Neves, R., et al. Síntesis y caracterización de péptidos autoensamblables modificados con 1,2-ditiolano. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el autoensamblaje de péptidos amiloides en una estructura supramolecular rica en láminas beta utilizando espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier. Se pasa un rayo infrarrojo a través de un cristal con un alto índice de refracción y se registra la absorción de energía a través de la interfaz del cristal y la muestra. Las estructuras secundarias de las proteínas de la muestra se identifican analizando sus picos de absorción característicos en regiones específicas del espectro infrarrojo, lo que ayuda a identificar la formación del ensamblaje supramolecular.

Protocolo

1. Caracterización de estructuras de autoensamblaje supramolecular

1. Formación de fibras amiloides
   1. Para preparar una solución de autoensamblaje, pesar 1 mg del péptido en polvo utilizando una balanza analítica. Disolver en una mezcla (pH 7,5) de acetonitrilo al 20% y ácido 10 mM (4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, hasta una concentración final de 1 mg/ml de mezcla de ensamblaje de péptidos. Agite la solución de ensamblaje y déjela ensamblar a temperatura ambiente.
2. Caracterización espectroscópica de fibras amiloides
   1. Siga el proceso de ensamblaje de péptidos a través de la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) cada pocos días. Un pico amplio centrado alrededor de 1670 ^cm-1 es la firma IR que surge de péptidos no ensamblados en la muestra. Las muestras de ensamblaje de péptidos generalmente tardan de una a dos semanas para que el pico ancho sin ensamblar desaparezca y alcance la maduración.
      1. Seque una alícuota de 8-10 μL de la solución de ensamblaje como una película delgada sobre el cristal de diamante ATR. Monitoree la desaparición de un pico de agua grande y ancho de 1640 a 1630 ^cm-1 a medida que se forma la película seca.
      2. Adquiera espectros IR de 1500-1800 ^cm-1 con un promedio de 50 escaneos con una resolución ^{de 2 cm-1}. Adquiera y reste los escaneos en segundo plano antes de cada escaneo de muestra. La firma IR para el ensamblaje de β hojas es un pico agudo entre 1625 y 1635 ^cm-1 (Figura 1A).

Resultados

Figura 1. Caracterización supramolecular del péptido modificado con 1,2-ditiolano. (A) FT-IR de 1 mg/mL de fibras de 1,2-ditiolano-KLVFFAQ-NH₂ ensambladas en HEPES de 10mM, pH 7,5 en 20% CH₃CN. El pico a 1627 ^cm-1 es consistente...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetonitrilo	Fisher Scientific	A998-4	Inflamable; irritante para los ojos; Usar equipo de protección personal; Úselo solo debajo de una campana extractora; mantener alejado de llamas abiertas o superficies calientes; en caso de contacto, enjuague con agua durante al menos 15 minutos y obtenga atención médica
Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico	Acros Organics	AC172571000	No inhale; úselo al aire libre o en un área bien ventilada
Espectrómetro infrarrojo por transformada de Fourier	Alpha Tensor, Bruker