Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)
Summary
Es wird ein Verfahren zur effizienten Reinigung von Doppel Strep-tag-Fusionsproteine und deren Komplexe spezifisch auf modifizierte Streptavidin beschrieben (Strep-Tactin)-Harz kovalent mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) vernetzt. Das Verfahren hat die Vorteile der schnellen Geschwindigkeit, gute Zielprotein Recovery und hohe Reinheit und ist mit nachfolgender Analyse durch Massenspektrometrie kompatibel.
Abstract
Affinitätsreinigung von Strep-markierten Fusionsproteinen auf Harze Durchführung eines manipulierten Streptavidin (Strep-Tactin) hat sich eine weit verbreitete Methode zur Isolierung von Proteinkomplexen unter physiologischen Bedingungen. Fusionsproteine, zwei Kopien von Strep-tag II, Twin-Strep-Tag oder SIII-Tag bezeichnet, enthalten, haben den Vorteil der höheren Affinität für Strep-Tactin Vergleich zu denen nur eine einzige Strep-Tag enthält, so dass eine effizientere Proteinreinigung. Allerdings wird dieser Vorteil durch die Tatsache, dass die Elution von Zwillings-Strep-markierte Proteine mit Biotin kann unvollständig sein, was zu einer geringen Proteinrückgewinnung auszugleichen. Die Rückgewinnung kann durch die Verwendung stark denaturierender Elution mit Natriumdodecylsulfat (SDS) verbessert werden, aber dies führt zu einer Kontamination mit Strep-Tactin aus dem Harz freigesetzt abzutasten, so dass der Test nicht mit nachgeschalteten Proteomanalyse. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir ein Verfahren, bei dem mit Harz gekoppelt Tetramer von Strep-Tactin entwickeltenZunächst wird durch kovalente Quervernetzung mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) und die resultierende vernetzte Harz wird dann verwendet, um Zielprotein-Komplexe in einer einzigen Charge zu reinigen Reinigungsschritt stabilisiert. Effiziente Elution mit SDS-Protein sorgt für eine gute Erholung, während der Abwesenheit von kontaminierenden Strep-Tactin ermöglicht Downstream-Protein-Analyse durch Massenspektrometrie. Als Proof of Concept, beschreiben wir hier ein Protokoll für die Reinigung von SIII-markierten viralen Protein VPg-Pro aus Kernen von Virus-infizierten N. benthamiana-Pflanzen mit dem Strep-Tactin Polymethacrylatharz mit BS3 vernetzt. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um jede Doppel Strep-markierten Protein von Interesse reinigen und zu charakterisieren seine physiologischen Bindungspartner werden.
Introduction
In den letzten Jahren hat Strep-Tag-Technologie in vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung, einschließlich der Proteomforschung und Strukturbiologie weit verbreitet. Diese Technologie zur Proteinreinigung, die auf der Fusion von rekombinanten Proteinen an einer kurzen Strep-tag-Peptid beruht, mit dem Aufkommen von Affinitätsmatrizes Durchführung Strep-Tactin, eine gentechnisch Variante von Streptavidin mit verbesserter Peptid-Bindungsfähigkeit 1, 2 gereift. Fusionsproteine, zwei Kopien von Strep-tag II, Twin-Strep-Tag oder SIII-Tag, zeigen eine höhere Affinität für Strep-Tactin Matrizen als solche, die nur eine einzige Strep-Tag, eine effizientere Reinigung der rekombinanten Proteine und bezeichnet enthält ihre zugeordneten Bindungspartnern. Allerdings hat der höhere Affinität von Twin-Strep-markierte Proteine zu Strep-Tactin auch seine Kehrseite. Kompetitive Elution derartiger Proteine mit einem Überschuss Biotin kann unvollständig sein, was zu einer verringerten Ausbeute Zielprotein. A mErz effiziente Alternative ist die Elution mit SDS, aber es führt zu unerwünschten Kontamination der Probe mit Strep-Tactin aus dem Harz freigesetzt, so dass der Test nicht mit Proteomanalyse. Dieser Artikel stellt eine Technik, um diese Beschränkung durch die ersten Stabilisierungs harzgekuppelten Tetramer von Strep-Tactin durch chemische Vernetzung und dann unter Verwendung von SDS zur Doppel-Strep-markierte Proteine und ihre zugehörigen Komplexe aus der resultierenden vernetzten Harz zu eluieren überwinden. Somit kann eine ausreichende Proteinausbeute ohne Kontamination der Probe mit Strep-Tactin erreicht werden, wodurch eine weitere Analyse durch Massenspektrometrie erlaubt.
Das Verfahren ist mit einer oberflächenexponierten SIII-Tag 3 oder Twin-Strep-Tag (Aminosäuresequenz WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK und SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK jeweils) geeignet für die Reinigung von jedem rekombinantes Fusionsprotein. Das Protein kann aus tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs sein und kann entweder aus insgesamt Zelle isoliert werdenLysat oder angereicherten Organell-Fraktion. Als Beispiel beschreiben wir hier die Reinigung eines SIII-markierten Protein VPg-Pro von Kartoffelvirus A (PVA) 4 von der Kernfraktion von PVA-infizierten Nicotiana benthamiana Pflanzen. Die Kernfraktion wurde isoliert, wie zuvor beschrieben 5, mit den folgenden Modifikationen: die Zellen wurden nicht mit Formaldehyd behandelt wurde Natriumbutyrat in alle Puffer mit 5 mM Natriumfluorid ersetzt wurde komplette Proteaseinhibitor PMSF substituiert mit Triton X-100-Konzentration im Extraktions Puffer # 2 wurde auf 0,3% gesenkt (v / v) und das Kernpellet durch Zentrifugation über Saccharose-Kissen (Extraktionspuffer # 3) erhalten wurde in 1,45 ml vorgekühltem Bindungspuffer resuspendiert und gedreht wird 1,5 Stunden bei 4 ° C. Die daraus resultierende Kernextrakt die SIII-markierten Köderprotein und die damit verbundenen Komplexe (Köder Proteinprobe) enthält, wurde gemäß dem unten beschriebenen (siehe Abschnitt 2)-Protokoll verarbeitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das obige Protokoll kann verwendet werden, um jede Doppel Strep-getaggte Köder Protein von Interesse und die damit verbundenen Komplexe in jeder geeigneten Puffer, die nicht Biotin oder starke Vergällungsmittel enthält reinigen. In der aktuellen Version des Protokolls, Bindung und Waschen unter relativ stringenten Bedingungen in der Gegenwart von hohen Salz und nicht-ionischen Detergens durchgeführt. Dies führt zwar zu weniger Hintergrund, kann fragilen Proteinkomplexe unter diesen Bedingungen zu distanzieren. Um s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die technische Unterstützung von Sini Miettinen, Minna Pöllänen und Taru Rautavesi. Wir bedanken uns für die Bereitstellung Helka Nurkkala HEK 293-Zellen, die Twin-Strep-getaggte GFP und Pekka Evijärvi für die Bereitstellung von Aufnahmegerät. Diese Arbeit wurde von der Akademie von Finnland finanziert, gewähren Nummern 138329, 134684 und 258978.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
Referencias
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).
