本文描述了一种高效纯化双Strep标签融合蛋白及其特异性复合物的方法，该方法采用经Bis(sulfosuccinimidyl) suberate（BS3）共价交联修饰的链霉亲和素（Strep-Tactin）树脂。该方法具有速度快、目标蛋白回收率高和纯度高等优点，并可兼容后续的质谱分析。
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方法文章
一步纯化双Strep-tag标记蛋白及其复合物的Strep-Tactin树脂交联方法：使用BS3（Bis(sulfosuccinimidyl) suberate）交联树脂
本文内容
摘要
摘要
利用携带工程化链霉亲和素（Strep-Tactin）的树脂进行Strep标签融合蛋白的亲和纯化，已成为在生理条件下分离蛋白复合物的常用方法。含有两个Strep-tag II拷贝的融合蛋白（称为双Strep标签或SIII标签）相较于仅含单个Strep标签的蛋白，对Strep-Tactin具有更高的亲和力，从而实现更高效的蛋白纯化。然而，这一优势被以下事实所抵消：使用生物素洗脱双Strep标签蛋白时可能不完全，导致蛋白回收率低。通过使用十二烷基硫酸钠（SDS）进行变性洗脱可显著提高回收率，但这会导致树脂中释放出Strep-Tactin污染样品，使该方法无法适用于后续的蛋白质组学分析。为克服这一局限，我们开发了一种方法：首先使用Bis(sulfosuccinimidyl) suberate（BS3）对树脂偶联的Strep-Tactin四聚体进行共价交联以实现稳定化，然后使用该交联树脂通过单步批量纯化方式纯化目标蛋白复合物。使用SDS高效洗脱可确保良好的蛋白回收率，同时由于无Strep-Tactin污染，可进一步通过质谱法进行下游蛋白分析。作为概念验证，本文描述了一种利用经BS3交联的Strep-Tactin聚甲基丙烯酸树脂从感染病毒的本氏烟（N. benthamiana）植物细胞核中纯化SIII标签病毒蛋白VPg-Pro的实验方案。该方案同样适用于纯化任何感兴趣的双Strep标签蛋白，并鉴定其生理状态下的结合伴侣蛋白。
引言
近年来，Strep-tag 技术已广泛应用于生物医学研究的多个领域，包括蛋白质组学和结构生物学。这种蛋白质纯化技术依赖于将重组蛋白与短的 Strep-tag 肽段融合，随着携带有 Strep-Tactin 的亲和基质的出现，该技术日趋成熟。Strep-Tactin 是链霉亲和素（streptavidin）的一种基因工程改造变体，具有更强的肽段结合能力1,2。含有两个 Strep-tag II 拷贝的融合蛋白（称为 twin-Strep-tag 或 SIII-tag）对 Strep-Tactin 基质的亲和力高于仅含单个 Strep-tag 的蛋白，从而可更高效地纯化重组蛋白及其结合伙伴。然而，twin-Strep-tag 蛋白与 Strep-Tactin 之间的高亲和力也存在缺点：使用过量生物素进行竞争性洗脱可能不完全，导致目标蛋白得率降低。另一种更有效的替代方法是使用 SDS 洗脱，但这会导致树脂中释放出 Strep-Tactin，造成样品污染，因而无法用于蛋白质组学分析。本文介绍一种克服该局限性的技术：首先通过化学交联稳定树脂偶联的 Strep-Tactin 四聚体，然后利用 SDS 从交联后的树脂中洗脱 twin-Strep-tag 蛋白及其相关复合物。由此可在不造成 Strep-Tactin 污染的前提下获得足够的蛋白得率，从而允许后续进行质谱分析。
该方法适用于纯化任何具有表面暴露SIII标签
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方案
1. 使用双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯（BS3）交联Strep-Tactan聚甲基丙烯酸酯树脂
- 将一支密封的微量离心管（内含 2 mg BS3 交联剂）平衡至室温。注意：BS3 为危险物质，操作时需佩戴防护手套和护目镜。
- 通过短暂剧烈振荡重悬 Strep-Tactin 聚甲基丙烯酸酯树脂（100 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA；150 mM NaCl 中的 50% 悬浮液），然后使用切去尖端的移液器吸头立即将 600 µl 悬浮液转移至离心柱中。
- 在室温下以 1,500 × g 离心 30 秒，弃去穿流液，并向柱中加入 450 µl 磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 重复上一步骤 2 次，以完全用 PBS 替代 Tris 缓冲液，最后一次离心后使树脂悬浮于 430 µl pH 8.0 的 PBS 中。
- 用含有 100 µl 超纯水的移液器吸头刺穿装有 BS3 的微量离心管铝箔封口，通过轻柔吹打使 BS3 粉末溶解于水中，立即取 20 µl 该溶液加入离心柱中。交联反应中 BS3 的终浓度约为 1.2 mM。
- 在室温下旋转孵育柱子 30 分钟，检查树脂是否与 BS3 溶液充分混合。
- 为终止反应，加入 6 µl 3 M Tris-HCl（pH 7.5），并在室温下继续旋转孵育 15 分钟。
- 在室温下以 1,500 × g 离心 30 秒，弃去穿流液，用....
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结果
纯化流程在图1中以示意图形式展示，同时展示了其他现有纯化方法所存在的问题。
图1. 纯化流程的示意图。该实验流程包括：利用BS3对树脂偶联的Strep-Tactin四聚体进行共价交联以稳定其结构，使带有双Strep标签的诱饵蛋白及其相关复合物结合到交联后的树脂上，洗去未结合的蛋白质，用1% SDS进行变性洗脱，特异性结合的蛋白复合物随后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。诱饵蛋白中的两个红色球体代表双Strep标签。右侧插图框中列出了.......
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讨论
上述方案可用于在不含生物素或强变性剂的任何合适缓冲液中纯化任意感兴趣的双Strep标签诱饵蛋白及其相关复合物。在本方案的当前版本中，结合与洗涤步骤是在高盐和非离子型去污剂存在的相对严格条件下进行的。尽管这能够减少背景干扰，但脆弱的蛋白质复合物可能在这些条件下发生解离。为了保留此类低亲和力复合物，可降低结合缓冲液和洗涤缓冲液中的盐浓度，并减少或省略其中的非离子型去污剂。
双Strep标签系统的主要优势在于，这种小分子（3 kDa）串联标签与改造后的链霉亲和素（Strep-Tactin）具有高亲和力1,2，即使在批次模式下也能实现目标蛋白及其复合物的高效一步纯化。由于双Strep标签与Strep-Tactin结合牢固，树脂可在中等严格条件下进行洗涤，例如使用高浓度去污剂和/或高盐浓度，从而获得更高纯度的目标蛋白。然而，这种强结合也存在缺点。即使对于仅带有一个Strep-tag II（氨基酸序列WSHPQFEK）的蛋白，从树脂上的竞争性洗脱有时也可能困难。例如，使用10 mM 脱硫生物素（desthiobiotin）从St.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们衷心感谢 Sini Miettinen、Minna Pöllänen 和 Taru Rautavesi 提供的技术支持。感谢 Helka Nurkkala 提供表达双Strep标签GFP的HEK 293细胞，以及 Pekka Evijärvi 提供录音设备。本工作由芬兰科学院资助，资助编号为 138329、134684 和 258978。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯（BS3），无需称重格式，8 × 2 mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com 警告：有害物质。可引起严重的呼吸道、皮肤和眼睛刺激。佩戴防护手套和眼部保护装置。 |
| Strep-Tactin MacroPrep 树脂（50% 悬浮液） | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X 离心管滤器，醋酸纤维素膜，孔径 0.45 μm，非无菌 | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| 圆底管（Dolphin-nose tubes） | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| 亲和素 | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
参考文献
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A.
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重印与许可
