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一步纯化双Strep-tag标记蛋白及其复合物的Strep-Tactin树脂交联方法：使用BS3（Bis(sulfosuccinimidyl) suberate）交联树脂

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DOI：

10.3791/51536

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2014年4月20日

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1Department of Food and Environmental Sciences, University of Helsinki, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki

本文内容

摘要

本文描述了一种高效纯化双Strep标签融合蛋白及其特异性复合物的方法，该方法采用经Bis(sulfosuccinimidyl) suberate（BS3）共价交联修饰的链霉亲和素（Strep-Tactin）树脂。该方法具有速度快、目标蛋白回收率高和纯度高等优点，并可兼容后续的质谱分析。

摘要

利用携带工程化链霉亲和素（Strep-Tactin）的树脂进行Strep标签融合蛋白的亲和纯化，已成为在生理条件下分离蛋白复合物的常用方法。含有两个Strep-tag II拷贝的融合蛋白（称为双Strep标签或SIII标签）相较于仅含单个Strep标签的蛋白，对Strep-Tactin具有更高的亲和力，从而实现更高效的蛋白纯化。然而，这一优势被以下事实所抵消：使用生物素洗脱双Strep标签蛋白时可能不完全，导致蛋白回收率低。通过使用十二烷基硫酸钠（SDS）进行变性洗脱可显著提高回收率，但这会导致树脂中释放出Strep-Tactin污染样品，使该方法无法适用于后续的蛋白质组学分析。为克服这一局限，我们开发了一种方法：首先使用Bis(sulfosuccinimidyl) suberate（BS3）对树脂偶联的Strep-Tactin四聚体进行共价交联以实现稳定化，然后使用该交联树脂通过单步批量纯化方式纯化目标蛋白复合物。使用SDS高效洗脱可确保良好的蛋白回收率，同时由于无Strep-Tactin污染，可进一步通过质谱法进行下游蛋白分析。作为概念验证，本文描述了一种利用经BS3交联的Strep-Tactin聚甲基丙烯酸树脂从感染病毒的本氏烟（N. benthamiana）植物细胞核中纯化SIII标签病毒蛋白VPg-Pro的实验方案。该方案同样适用于纯化任何感兴趣的双Strep标签蛋白，并鉴定其生理状态下的结合伴侣蛋白。

引言

近年来，Strep-tag 技术已广泛应用于生物医学研究的多个领域，包括蛋白质组学和结构生物学。这种蛋白质纯化技术依赖于将重组蛋白与短的 Strep-tag 肽段融合，随着携带有 Strep-Tactin 的亲和基质的出现，该技术日趋成熟。Strep-Tactin 是链霉亲和素（streptavidin）的一种基因工程改造变体，具有更强的肽段结合能力1,2。含有两个 Strep-tag II 拷贝的融合蛋白（称为 twin-Strep-tag 或 SIII-tag）对 Strep-Tactin 基质的亲和力高于仅含单个 Strep-tag 的蛋白，从而可更高效地纯化重组蛋白及其结合伙伴。然而，twin-Strep-tag 蛋白与 Strep-Tactin 之间的高亲和力也存在缺点：使用过量生物素进行竞争性洗脱可能不完全，导致目标蛋白得率降低。另一种更有效的替代方法是使用 SDS 洗脱，但这会导致树脂中释放出 Strep-Tactin，造成样品污染，因而无法用于蛋白质组学分析。本文介绍一种克服该局限性的技术：首先通过化学交联稳定树脂偶联的 Strep-Tactin 四聚体，然后利用 SDS 从交联后的树脂中洗脱 twin-Strep-tag 蛋白及其相关复合物。由此可在不造成 Strep-Tactin 污染的前提下获得足够的蛋白得率，从而允许后续进行质谱分析。

该方法适用于纯化任何具有表面暴露SIII标签3或双Strep标签（氨基酸序列分别为WSHPQFEK(GGGS)3 WSHPQFEK和SAWSHPQFEK(GGGS)2 GGSAWSHPQFEK）的重组融合蛋白。目标蛋白可来源于动物、植物或细菌，并可从全细胞裂解液或富集的细胞器组分中分离。作为示例，本文描述了从感染马铃薯A病毒（PVA）的本氏烟（Nicotiana benthamiana）植物的核组分中纯化SIII标签蛋白VPg-Pro的过程4。核组分的制备方法如前所述5，但进行了以下修改：不使用甲醛处理细胞，所有缓冲液中的丁酸钠被5 mM氟化钠替代，完全蛋白酶抑制剂被PMSF替代，提取缓冲液#2中的Triton X-100浓度降低至0.3%（v/v），并通过蔗糖垫（提取缓冲液#3）离心获得的细胞核沉淀重悬于1.45 ml预冷的结合缓冲液中，在4 °C下旋转孵育1.5小时。所得的核提取物含有SIII标签的诱饵蛋白及其相关复合物（即诱饵蛋白样品），随后按照下述方案进行处理（见第2节）。

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方案

1. 使用双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯（BS3）交联Strep-Tactan聚甲基丙烯酸酯树脂

  1. 将一支密封的微量离心管（内含 2 mg BS3 交联剂）平衡至室温。注意：BS3 为危险物质，操作时需佩戴防护手套和护目镜。
  2. 通过短暂剧烈振荡重悬 Strep-Tactin 聚甲基丙烯酸酯树脂（100 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA；150 mM NaCl 中的 50% 悬浮液），然后使用切去尖端的移液器吸头立即将 600 µl 悬浮液转移至离心柱中。
  3. 在室温下以 1,500 × g 离心 30 秒，弃去穿流液，并向柱中加入 450 µl 磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
  4. 重复上一步骤 2 次，以完全用 PBS 替代 Tris 缓冲液，最后一次离心后使树脂悬浮于 430 µl pH 8.0 的 PBS 中。
  5. 用含有 100 µl 超纯水的移液器吸头刺穿装有 BS3 的微量离心管铝箔封口，通过轻柔吹打使 BS3 粉末溶解于水中，立即取 20 µl 该溶液加入离心柱中。交联反应中 BS3 的终浓度约为 1.2 mM。
  6. 在室温下旋转孵育柱子 30 分钟，检查树脂是否与 BS3 溶液充分混合。
  7. 为终止反应，加入 6 µl 3 M Tris-HCl（pH 7.5），并在室温下继续旋转孵育 15 分钟。
  8. 在室温下以 1,500 × g 离心 30 秒，弃去穿流液，用 450 µl 含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）重悬交联后的树脂。重复离心和洗涤步骤 2 次。最后一步中，用 450 µl TBS 重悬树脂。
  9. 使用切去尖端的移液器吸头将树脂悬浮液转移至新的离心管中。用另外 450 µl TBS 重悬残留在柱中的树脂，并转移至同一管中。重复此步骤一次，以确保将树脂从柱中最大程度转移至管中。
  10. 将管子在室温下静置 10 分钟，通过去除过量 TBS 将体积调整至 600 µl。该树脂可立即使用（推荐），或在 4 °C 下保存，避免冷冻。

2. 双Strep标签诱饵蛋白及其相关复合物与交联Strep-Tactin聚甲基丙烯酸酯树脂的结合

  1. 在 4 °C 条件下，以 17,000 × g 离心 1 ml 结合缓冲液中的诱饵蛋白样品 10 分钟，然后将上清液转移至新的离心管中。
  2. 为最大限度减少内源性生物素化蛋白与 Strep-Tactin 树脂的结合，加入亲和素（avidin），使其终浓度达到 100 µg/ml，并在 4 °C 下旋转孵育 15 分钟。
    1. 若步骤 1.10 中的交联树脂在 4 °C 下长期储存，需在 4 °C 下以 400 × g 离心 1 分钟收集树脂，弃去上清液，并用 1 ml TBST 洗涤树脂。重复离心和洗涤步骤两次，第一次使用 TBST，第二次使用 TBS。在 4 °C 下以 400 × g 离心 1 分钟后，通过去除过量 TBS 将树脂调整至原始体积。
  3. 通过涡旋重悬交联的 Strep-Tactin 树脂。立即使用剪口移液枪头将 50 µl 树脂悬液加入含有诱饵蛋白样品的离心管中，并在 4 °C 下旋转孵育 30 分钟。
  4. 等待期间，将恒温混匀仪设定至 55 °C，并预热 500 µl 洗脱缓冲液，用于后续步骤 3.1。
  5. 在 4 °C 下以 400 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，用 1 ml 预冷的洗涤缓冲液 #1 在旋转器上 4 °C 洗涤树脂 5 分钟。重复离心和洗涤步骤三次。最后一次步骤中，将树脂重悬于 250 µl 洗涤缓冲液 #2 中。
  6. 将树脂悬液转移至新的离心柱中。将离心管中残留的树脂用另外 250 µl 洗涤缓冲液 #2 重悬，并转移至同一离心柱中。
  7. 在 4 °C 下以 400 × g 离心 3 分钟，弃去穿流液，并将离心柱转移至新的 2 ml “海豚鼻”离心管中。立即进行下述洗脱步骤。

3. 特异性蛋白质复合物的洗脱

  1. 向离心柱中加入150 µl 来自步骤2.4的预热洗脱缓冲液。
  2. 在55 °C下于恒温混匀仪中孵育5分钟，转速为1,400 rpm。
  3. 在室温下以1,500 × g离心1分钟。
  4. 弃去离心柱，将纯化的目标蛋白储存于≤ -20 °C。
磷酸盐缓冲液（PBS）
Na2HPO410 mM
KH2PO42 mM
NaCl137 mM
KCl2.7 mM
pH 调至 7.4，除非另有说明（第 1.4 节中为 pH 8.0）
Tris 缓冲盐水（TBS）
Tris-HCl，pH 7.450 mM
NaCl150 mM
含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）
Tris-HCl，pH 7.450 mM
NaCl150 mM
Tween 200.1% (v/v)
结合缓冲液
Tris-HCl，pH 8.025 mM
NaCl550 mM
NaF5 mM
EDTA0.5 mM
甘油10% (v/v)
PMSF0.1 mM
洗涤缓冲液 #1
Tris-HCl，pH 8.025 mM
NaCl500 mM
NaF5 mM
EDTA0.4 mM
Igepal CA-6300.2% (v/v)
甘油5% (v/v)
PMSF0.1 mM
洗涤缓冲液 #2
Tris-HCl，pH 8.025 mM
NaCl150 mM
洗脱缓冲液
Tris-HCl，pH 8.025 mM
SDS1% (w/v)

表1. 本研究中使用的缓冲液。

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结果

纯化流程在图1中以示意图形式展示，同时展示了其他现有纯化方法所存在的问题。

使用Strep-Tactin、SDS-PAGE和LC-MS/MS分析进行蛋白质纯化的流程图。
图1. 纯化流程的示意图。该实验流程包括：利用BS3对树脂偶联的Strep-Tactin四聚体进行共价交联以稳定其结构，使带有双Strep标签的诱饵蛋白及其相关复合物结合到交联后的树脂上，洗去未结合的蛋白质，用1% SDS进行变性洗脱，特异性结合的蛋白复合物随后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。诱饵蛋白中的两个红色球体代表双Strep标签。右侧插图框中列出了...

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讨论

上述方案可用于在不含生物素或强变性剂的任何合适缓冲液中纯化任意感兴趣的双Strep标签诱饵蛋白及其相关复合物。在本方案的当前版本中，结合与洗涤步骤是在高盐和非离子型去污剂存在的相对严格条件下进行的。尽管这能够减少背景干扰，但脆弱的蛋白质复合物可能在这些条件下发生解离。为了保留此类低亲和力复合物，可降低结合缓冲液和洗涤缓冲液中的盐浓度，并减少或省略其中的非离子型去污剂。

双Strep标签系统的主要优势在于，这种小分子（3 kDa）串联标签与改造后的链霉亲和素（Strep-Tactin）具有高亲和力1,2，即使在批次模式下也能实现目标蛋白及其复合物的高效一步纯化。由于双Strep标签与Strep-Tactin结合牢固，树脂可在中等严格条件下进行洗涤，例如使用高浓度去污剂和/或高盐浓度，从而获得更高纯度的目标蛋白。然而，这种强结合也存在缺点。即使对于仅带有一个Strep-tag II（氨基酸序列WSHPQFEK）的蛋白，从树脂上的竞争性洗脱有时也可能困难。例如，使用10 mM 脱硫生物素（desthiobiotin）从St...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们衷心感谢 Sini Miettinen、Minna Pöllänen 和 Taru Rautavesi 提供的技术支持。感谢 Helka Nurkkala 提供表达双Strep标签GFP的HEK 293细胞，以及 Pekka Evijärvi 提供录音设备。本工作由芬兰科学院资助，资助编号为 138329、134684 和 258978。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯（BS3），无需称重格式，8 × 2 mgPierce/Thermo Scientific21585www.fishersci.com 警告：有害物质。可引起严重的呼吸道、皮肤和眼睛刺激。佩戴防护手套和眼部保护装置。
Strep-Tactin MacroPrep 树脂（50% 悬浮液）IBA2-1505www.iba-lifesciences.com
Spin-X 离心管滤器，醋酸纤维素膜，孔径 0.45 μm，非无菌Costar (Corning)8163www.corning.com/lifesciences/
圆底管（Dolphin-nose tubes）Costar (Corning)3213www.corning.com/lifesciences/
亲和素 IBA2-0204www.iba-lifesciences.com

参考文献

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Strep BS3 SDS VPg Pro

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