É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.
Artigo de método
Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)
Neste artigo
Resumo
Resumo
A purificação por afinidade das proteínas de fusão marcadas com Strep-resinas que transportam um estreptavidina engenharia (Strep-Tactin) tornou-se um método utilizado para o isolamento de complexos de proteínas sob condições fisiológicas. As proteínas de fusão que contêm duas cópias de Strep-tag II, designadas-Strep-tag ou duplo SIII-tag, têm a vantagem de uma maior afinidade para o Strep-Tactin em comparação com aquelas que contêm apenas um Strep-tag único, permitindo assim a purificação da proteína mais eficiente. No entanto, esta vantagem é compensada pelo fato de que a eluição de proteínas twin-Strep-marcadas com biotina pode ser incompleta, levando a baixa recuperação de proteína. A recuperação pode ser drasticamente melhorada utilizando desnaturação eluição com dodecil-sulfato de sódio (SDS), mas isto conduz a amostra de contaminação com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteómica jusante. Para superar esta limitação, temos desenvolvido um método pelo qual tetrâmero acoplados à resina de Strep-Tactiné estabilizada pela primeira vez por reticulação covalente com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3), e a resina com ligações cruzadas resultante é, então, utilizada para purificar complexos de proteínas-alvo em um único passo de purificação por lotes. Eluição eficiente com SDS garante uma boa recuperação de proteína, enquanto a ausência de contaminação Strep-Tactin permite a análise de proteínas downstream por espectrometria de massa. Como prova do conceito, aqui descrita de um protocolo para a purificação de proteínas virais SIII marcado com VPg-Pro a partir de núcleos de N. infectadas com vírus benthamiana plantas utilizando a resina de polimetacrilato Strep-Tactin reticulados com BS3. O mesmo protocolo pode ser utilizado para purificar qualquer proteína duplo-Strep-tag de interesse e caracterizar os seus parceiros de ligação fisiológicas.
Introdução
Nos últimos anos, a tecnologia Strep-tag tornou-se amplamente utilizado em muitas áreas de pesquisa biomédica, incluindo proteômica e biologia estrutural. Esta tecnologia de purificação de proteínas, o qual baseia-se na fusão de proteínas recombinantes a um péptido curto Strep-tag, amadureceu com o advento de matrizes de afinidade que transportam Strep-Tactin, uma variante geneticamente modificada de estreptavidina com uma melhor capacidade de ligação de péptidos 1, 2. As proteínas de fusão contendo duas cópias do Strep-tag II, designados-Strep-tag ou twin-tag SIII, exibem uma maior afinidade para matrizes Strep-Tactin do que aqueles que contêm apenas uma tag Strep único, garantindo a purificação mais eficiente das proteínas recombinantes e seus parceiros de ligação associados. No entanto, a maior afinidade de proteínas twin-Strep-tag para Strep-Tactin também tem seu lado negativo. Eluição competitiva de tais proteínas, com o excesso de biotina pode ser incompleta, levando à produção de proteína alvo diminui. Um mminério eficiente alternativa é a eluição com SDS, mas conduz a uma contaminação indesejada da amostra com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteoma. Este documento apresenta uma técnica para superar esta limitação, o primeiro estabilizador tetrâmero acoplado à resina de Strep-Tactin por reticulação química e, em seguida, utilizando SDS para eluir proteínas de duplo Strep-tag e os seus complexos associados a partir da resina com ligações cruzadas resultante. Assim, o rendimento de proteína suficiente pode ser conseguida sem a contaminação da amostra com Strep-Tactin, permitindo, assim, ainda mais a análise por espectrometria de massa.
O método é adequado para a purificação de qualquer proteína de fusão recombinante com uma etiqueta de SIII exposto à superfície ou 3-Strep-tag duplo (WSHPQFEK sequência de aminoácidos (GGGS) 3 WSHPQFEK SAWSHPQFEK e (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectivamente). A proteína pode ser de origem animal, vegetal ou de origem bacteriana e pode ser isolado a partir de qualquer célula totaislisado ou fracção enriquecida organelo. Como exemplo, descrevemos aqui a purificação de uma proteína marcada com SIII VPg-Pro de batata vírus A (PVA) 4 a partir da fracção nuclear de PVA-infectadas de plantas de Nicotiana benthamiana. A fracção nuclear foi isolado como descrito anteriormente 5, com as seguintes modificações: As células não foram tratadas com o formaldeído, o butirato de sódio foi substituído em todos os tampões, com fluoreto de sódio 5 mM, inibidor de protease completo foi substituído com PMSF, Triton X-100 a concentração na extracção tampão # 2 foi reduzido para 0,3% (v / v) e o sedimento nuclear obtida por centrifugação através de almofada de sacarose (tampão de extracção # 3) foi novamente suspenso em 1,45 ml de tampão de ligação pré-refrigerado e rodado durante 1,5 horas a 4 ° C. O extrato nuclear resultante contendo a proteína isca SIII-marcados e complexos associados (amostra proteína isca) foi processado de acordo com o protocolo descrito a seguir (ver secção 2).
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Protocolo
1. Cross-linking de Strep-Tactin polimetacrilato Resina com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)
- Equilibrar um microtubo selado contendo 2 mg de BS3 de reticulação à temperatura ambiente. CUIDADO: BS3 é uma substância perigosa. Usar luvas e óculos de proteção.
- Resina de polimetacrilato Ressuspender Strep-Tactin (50% de suspensão em 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM; NaCl 150 mM) por breve agitação vigorosa e transferir imediatamente 600 uL da suspensão para uma coluna de centrifugação utilizando uma ponta de pipeta com a extremidade cortada.
- Centrifugar a 1.500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar o fluxo e adicionar 450 ul de salina tamponada com fosfato (PBS) para a coluna.
- Repetir o passo anterior mais 2 vezes para substituir completamente o tampão Tris com PBS e deixar a resina em 430 ul de PBS, ajustado a pH 8,0, após a última centrifugação.
- Perfurar a folha do microtubo com BS3 com uma ponteira que contém 1001; l de água ultrapura. Dissolver o pó em água BS3 cuidado pipetando para cima e para baixo e imediatamente adicionar 20 mL da solução para a coluna de centrifugação. A concentração final de BS3 na reacção de ligação cruzada é de aproximadamente 1,2 mM.
- Girar a coluna durante 30 minutos à temperatura ambiente. Verificar que a resina é misturada com a solução adequadamente BS3.
- Para terminar a reacção, adiciona-se 6 mL de Tris-HCl 3 M, pH 7,5 e a coluna rodar durante mais 15 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifugar a 1.500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar o fluxo e ressuspender a resina reticulada, em 450 ul de solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST). Repetir a centrifugação e passos de lavagem mais duas vezes. Na última etapa, ressuspender a resina em 450 ul de TBS.
- Transferir a suspensão de resina, para um tubo novo utilizando uma ponta de pipeta com a extremidade cortada. Ressuspender a resina deixada na coluna com mais 450 mL de TBS e transferir para o mesmo tubo. Repita ªe último passo mais uma vez para assegurar a transferência máxima da resina a partir da coluna para o tubo.
- Deixe o tubo de repousar durante 10 minutos à temperatura ambiente e ajustar o volume para 600 mL, removendo o excesso de TBS. A resina está pronta para utilização imediata (recomendado), ou pode ser armazenado a 4 ° C, sem congelação.
2. Ligação da proteína Bait Twin-Strep-marcados e Complexos Associated ao reticulado Strep-Tactin polimetacrilato Resina
- Centrifugar 1 ml da amostra de proteína isco em tampão de ligação a 17000 xg durante 10 min a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
- Para minimizar a ligação de proteínas biotiniladas endógenos para a resina de Strep-Tactin, adicionar avidina a uma concentração final de 100 ug / ml e rodar durante 15 min a 4 ° C.
- Se a resina reticulada do passo 1.10 foi armazenado durante um longo período de tempo, a 4 ° C, recolher a resina por centrifugação a 400 xg for 1 min a 4 ° C, deitar fora o sobrenadante e lava-se a resina com 1 ml de TBST. Repita a centrifugação e lavagem passos mais duas vezes, primeiro com TBST e, em seguida, com TBS. Centrifuga-se o tubo a 400 xg durante 1 min a 4 ° C e ajusta-se o volume original, removendo o excesso de TBS.
- Ressuspender a resina Strep-Tactin reticulado por vórtice. Imediatamente adicionar 50 ul da suspensão de resina para o tubo contendo a amostra de proteína isco utilizando uma ponta de pipeta de corte e rodar durante mais 30 minutos a 4 ° C.
- Enquanto espera, definido termomisturador a 55 ° C e pré-aquecer a 500 ul de tampão de eluição para o uso no passo 3.1.
- Centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e lava-se a resina sobre um rotador durante 5 min a 4 ° C com 1 ml de tampão de lavagem pré-refrigerada # 1. Repetir a centrifugação e passos de lavagem três vezes. Na última etapa, ressuspender a resina em 250 ul de tampão de lavagem # 2.
- Tr ansfer a suspensão de resina para uma coluna de rotação fresca. Ressuspender a resina remanescente no tubo em mais 250 ul de tampão de lavagem 2 e transferir a mesma coluna.
- Centrifugar a 400 xg por 3 min a 4 ° C, descarte o flow-through e transferir a coluna para um golfinho-nariz 2 tubo fresco ml. Vá imediatamente para a etapa de eluição abaixo.
3. Eluição de complexos de proteínas específicas
- Adicionar 150 ul de tampão de eluição pré-aquecida do passo 2.4 para a coluna de centrifugação.
- Incubar em termomisturador durante 5 min a 55 ° C, com agitação a 1400 rpm.
- Centrifugar a 1.500 xg durante 1 min à temperatura ambiente.
- Descartar a coluna e armazenar as proteínas alvo purificados a ≤ -20 ° C.
| Salina tamponada com fosfato (PBS) | |
| Na 2 HPO 4 | 10 mM |
| KH 2 PO 4 | 2 mM |
| NaCl | 137 mM |
| KCl | 2,7 mM |
| pH ajustado para 7,4, salvo indicação contrária (pH 8,0 na secção 1.4) | |
| Solução salina tamponada com Tris (TBS) | |
| Tris-HCl, pH 7,4 | 50 mM |
| ght = estilo "20" = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl | 150 mM |
| Solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST) | |
| Tris-HCl, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Tween 20 | 0,1% (v / v) |
| Tampão de ligação | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25 mM |
| NaCl | |
| NaF | 5 mM |
| EDTA | 0,5 mM |
| Glicerina | 10% (v / v) |
| PMSF | 0,1 mM |
| Lave tampão # 1 | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25 mM |
| NaCl | 500 mM |
| NaF td> | 5 mM |
| EDTA | 0,4 mM |
| Igepal CA-630 | 0,2% (v / v) |
| Glicerina | 5% (v / v) |
| PMSF | 0,1 mM |
| Lave tampão # 2 | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25 mM |
| SDS | 1% (w / v) |
Tabela 1. Tampões utilizados no presente estudo.
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Resultados
O procedimento de purificação está esquematicamente ilustrada na Figura 1, juntamente com uma representação de problemas associados com outros métodos de purificação existentes.
Figura 1. Representação esquemática do procedimento de purificação. O fluxo de trabalho inclui a estabilização da Strep-Tactin tet...
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Discussão
O protocolo acima pode ser utilizado para purificar qualquer proteína isco duplo-Strep-tag de interesse e os seus complexos associados em qualquer tampão adequado, que não contém biotina ou desnaturantes fortes. Na versão atual do protocolo, obrigatório e lavagem são realizadas em condições relativamente severas na presença de alto teor de sal e detergente não-iônico. Embora isto resulta em menos fundo, complexos de proteína frágeis podem dissociar sob estas condições. Para preservar os complexos de afinidade inferior, ...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio técnico da Sini Miettinen, Minna Pöllänen e Taru Rautavesi. Agradecemos Helka Nurkkala para fornecer HEK 293 células expressando twin-Strep-marcado GFP e Pekka Evijärvi para o fornecimento de equipamentos de gravação de som. Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia, conceder números 138329, 134684 e 258978.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Suberato de bis(sulfosuccinimidil) (BS3), formato sem pesagem, 8 x 2 mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CUIDADO: Substância perigosa. Causa irritação respiratória, cutânea e ocular grave. Use luvas de proteção e proteção para os olhos. |
| Resina Strep-Tactin MacroPrep (50% de suspensão) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Filtro de tubo de centrífuga Spin-X, membrana de acetato de celulose, tamanho dos poros 0,45 μ m, não estéril | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Tubos nariz de golfinho | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
Referências
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