PI (4,5) P 2 regulerer ulike cellulære funksjoner, men nanoskala organisasjon i cellen plasmamembranen er dårlig forstått. Ved merking PI (4,5) P-2 med en to-farge fluorescerende probe sammensmeltet til Pleckstrin Homologi domene, beskriver vi en ny tilnærming for å studere PI (4,5) P a romlig fordeling i plasmamembranen til nanometerskala .
Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.
Phosphoinositides bidra til en liten del av de totale membranlipider, men spiller avgjørende roller i en rekke forskjellige cellulære prosesser. De omfatter syv medlemmer som stammer fra reversibel fosforylering eller defosforylering av inositol ringene på 3., 4. og 5. posisjon 1. Fosfatidylinositol 4-fosfat (PI4P) og fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P 2) er to viktige phosphoinositides som fungerer relativt uavhengig som de avgjørende lipider av celleplasmamembran (PM) 2,3. Fosfatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) er mye mindre enn rikelig PI4P og PI (4,5) P 2, men det har unike funksjoner i ulike cellulære prosesser, inkludert kreft 4 og diabetes fem. Disse lipider har komplekse molekylære interaksjoner med sine effektbokser og mange andre proteiner. Derfor er det viktig å forstå den romlige organiseringen av disse phosphoinositides i PM på nanometer skala.
Montering bevis har vist at proteinkomplekser eller molekyl klynger i trange PM områder kan tjene som signaliserer hotspots 6. For eksempel syntaxin 1a, et nøkkelprotein som regulerer membranfusjon 7-9, viser klynge organisasjon i PM. Til forskjell fra konsensus visningen av klyngen organisering av syntaxin 1a, er den romlige fordelingen av phosphoinositides i PM kontroversielt. PI (4,5) P a fordelingsmønstre varierer fra uniform 10-12, store oppdateringer 13,14, for å tette klynger 14-18, avhengig av celletyper og eksperimentelle metoder som brukes. Den romlige organiseringen av PI (4,5) P 2 ved høyere oppløsning er også inkonsekvent. En undersøkelse ved hjelp av stimulert-utslipps uttømming (STED) mikroskopi 19 har avdekket et stort antall tett PI (4,5) P 2 nano-klynger (~ 73 nm i diameter) i PM ark av PC-12-celler 20 </sopp>. Dette resultatet er forskjellig fra studier med rask frysing elektronmikroskopi (EM) 21,22, en tilnærming som bevarer intakt PM strukturen i levende celler mye bedre enn kjemisk fiksering. Sistnevnte viste tydelige bassenger av PI (4,5) P 2; relativt konsentrert PI (4,5) P 2 i caveolae og belagte groper samt jevn fordeling på flat PM regionen. Videre kan nanoskala PI (4,5) P 2 organisasjon i membranplater varierer i levende og fikserte celler. Vår siste arbeid utredet saken, både faste og bor INS-1 celler ved hjelp av enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) 23.
SMLM er basert på stokastisk å bytte på bare en liten undergruppe av fluoroforer til enhver tid, slik at de enkelte fluoroforer kan lokaliseres med stor nøyaktighet. Mange super-Resolution Imaging tilnærminger har blitt utviklet ved hjelp av tilsvarende prinsipper for å overgå diffraksjon grensen av konvensjonell lysmikroskopi, sliks fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 24, fluorescens fotoaktivering lokalisering mikroskopi (FPALM) 25, stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM) 26,27 og direkte STORM (dSTORM) 28. Med foto valgbar eller photoactivatable fluoroforer (fargestoffer eller fluorescerende proteiner), SMLM teknikker tillate forskere til bilde biologiske strukturer på nanometer oppløsning 24,29,30 med video-rate i levende celler 31,32.
Bruke PI (4,5) P 2 som et eksempel, introduserte vi SMLM tilnærming for å studere nanoskala fordelingen av phosphoinositides på PM. PH domenet PLCδ1 (fosfolipase C δ1) som binder seg til PI (4,5) P 2 er et veletablert probe for bildebehandling PI (4,5) P a sub-cellulære distribusjon og dynamikk 33,34 i PM . Vi har genetisk merket dette domenet med to fluorescerende proteiner, PAmCherry1 35 og iRFP 36 </sup> for å produsere en dual-color fusjonsprotein (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (figur 1A-B). PAmCherry1 fungerer som photoactivatable probe av PH domene for PALM og iRFP fungerer som en generell indikator for å identifisere transfekterte celler før PALM oppkjøp . Vi bruker denne dual-farge fluorescerende probe for SMLM bildebehandling i de faste membraner. For levende PALM bildebehandling, merket vi mEOS3 37 i stedet for PAmCherry1 til PH PLCδ1 domene for å generere mEOS3.1-PH PLCδ1 probe for sin bedre foton effektivitet og lysstyrke (figur 1C-D).
SMLM avbildning med disse nye prober i PM av insulin-sekresjon INS-1 celler 38 har avdekket homogen merking av PI (4,5) P 2 i flertallet av PM regioner, samt konsentrert PI (4,5) P 2 mikroområder som er tynt insprängda i leiligheten PM og noen filopodia-lignende strukturer 23. Så ennoscale fordeling av PI (4,5) P 2 gir en strukturell utgangspunkt for å tenke nytt om hvordan den fungerer i levende celler.
For feilsøking, to prosesser trenger ekstra oppmerksomhet: membran produksjon og prøve fiksering. Som beskrevet i protokollen, er det inkubasjonstid på objektglassene i trinn 1.1.6 viktig for membranarket produksjon. Optimal inkubasjonstid i henhold til vårt eksperimentelle betingelse er 7-10 min (figur 2). Lenger enn 10 min inkubasjon vil produsere intakte celler i stedet for membraner i PDL-dekkglass og kortere inkubasjonstid vil føre til mindre eller ingen membran ark på PDL-belagte dekkglass. Som beskrevet i protokollen, den fiksativer og temperatur under fiksering er kritisk for å opprettholde den PI (4,5) P 2 fordeling i pm. Fiksering ved RT eller bruk av 4% -PFA alene kan forvrenge normal lipid fordelingen i PM.
Ved å bruke PALM mikros til membran lipid forskning, er vi i stand til å observere nanometer skala distribusjon av PI (4,5) P 2, en nøkkel phosphoinositide som formidler mnoen grunnleggende cellulære aktiviteter. Denne romlige fordelingen av PI (4,5) P 2 med begrensede konsentrasjons gradienter i INS-1 celler gir et rammeverk for å tenke nytt lipid-protein interaksjoner og lokale signal hendelsene i PI (4,5) P 2 i disse cellene. Videre kan metoder som er utviklet i dette arbeidet også anvendes for andre membranfosfolipid forskning med passende prober, for derved, å tilby nye verktøy for å studere phosphoinositides i biologiske prosesser.
Bruk av membraner i dette arbeidet omgår to store bekymringer i fosfolipid morfologiske studier: vaskemiddel behandling og potensielle signal forurensning fra cytosol. Vaskemidler ofte føre clustering og betydelig tap av PM fosfolipid signal. Forurensning av cytosolisk signal er spesielt problematisk når det gjelder lav overflod phosphoinositides på PM 23, for eksempel PI (3,4,5) P3 og PI (3,4) P-2. Membranen plateprøvene er i stand til å sirkuleremvent disse problemene uten i vesentlig grad å forstyrre strukturer forbundet med plasmamembranen, så som kortikal aktin nettverket og det klatrin-belagte groper 42,43. Den relative homogene fordeling av PI (4,5) P 2 i PM er i god overensstemmelse med andre raske frysing EM studier ved hjelp av GST-PH PLC δ1 sonder i fibroblast membran 44.
Det er viktig å merke seg at feil utvalgets behandling som kan danne misvisende resultater. For det første er det viktig å utføre festetrinn ved en lavere temperatur (4 ° C) og bruke den fiksativ GA for membranarket produksjon. Som vist i figur 3, er varm temperatur og PFA fiksering uten GA ikke er tilstrekkelig til å feste phosphoinositides i cellen PM. Dette kan forvrenge intakt PI (4,5) P 2 distribusjon og generere skarpe klynger som ikke er observert i levende celler under fysiologiske forhold. For det andre, bruk av PAmCherry1 somden SMLM sonde, snarere enn andre sonder, er avgjørende for kvantitativ PALM bildebehandling. Fordelen med PAmCherry1 søknaden kommer fra sine veldefinerte enkle molekylære foto fysiske egenskaper 35,40,45, som lysstyrke, høy fotoaktivering effektivitet og mest av alt, svært begrenset foto blinke. Disse egenskapene gjør oss i stand til å eliminere potensielle klase gjenstander fra foto blinker og kvantitativt analysere molekylær tetthet av membran PI (4,5) P 2.
Denne tilnærmingen har også sine begrensninger. For det første kan membranen arket fremgangsmåten anvendt i denne studien ikke fullt ut etterligner den fysiologiske fordelingen av PI (4,5) P 2 fordi cellen blir forstyrret før avbildning. Imidlertid viser vår live PALM bildebehandling lignende relativt homogen fordeling av PI (4,5) P 2, støtter resultatene observert med membran ark prøver. For det andre, som vi diskuterte i vår tidligere arbeid 23, krever SMLM Ekspertise og ekstra påtention å unngå bilde gjenstander som kan oppstå fra forskjellige prosesser, inkludert sondene brukes, prøveopparbeidelse og feste, bilde prøvetaking og gjenoppbygging. Til slutt, selv om PH domenebaserte prober og antistoffer er blitt mye brukt i fosfoinositid studier 46,47 er det fortsatt mulig at ikke alle PI (4,5) P 2 i membranen kan detekteres ved denne fremgangsmåten. For eksempel kan PI (4,5) P-2 bundet til andre endogene proteiner ikke være tilgjengelig for PH-prober eller antistoffer, og dette kan føre til en undervurdering av PI (4,5) P-2 på grunn av den plass hindring av sonde seg selv. En alternativ måte å merking PI (4,5) P 2 ville være med Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, en pre-merket PI (4,5) P 2 analog med en modifikasjon på halen av originale PI (4,5) P 2. Imidlertid kan den omdannes hurtig til andre undertyper av fosfoinositid rask levende cellemetabolisme siden inositol ingen er den samme som endogenous PI (4,5) P 2. Dette reiser bekymring om denne pre-merket PI (4,5) P 2 analoge i levende celler kan trofast representere PI (4,5) P 2 snarere enn sine metabolske produkter. Derfor, til tross for noen begrensninger, PH domene basert sonder er fortsatt blant de beste sonder som har blitt mye brukt til å overvåke PI (4,5) P 2 fordeling og dynamikk på PM av celler.
Den fremtidig anvendelse av denne metoden kan utvides til andre phosphoinositide studier, for eksempel PI (3,4,5) P3 og PI (3,4) P-2. Oppsummert romanen SMLM tilnærmingen som brukes her åpner nye måter å studere phosphoinositide i celler. Bruke PI (4,5) P 2 som et eksempel viser vi de unike egenskapene til PALM bildebehandling i den morfologiske og kvantitativ studie av cellemembranmolekyler, samt sine ulemper. Denne tilnærmingen kan tilpasses til andre molekyler steder og vil ha brede programmer i cellebiologi.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).
Microscope | Nikon | Ti-U | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405nm: 15 mW & 13 mW; 488nm: 45 mW & 42 mW; 561nm: 45 mW & 40 mW; 640nm: 35 mW & 16 mW. |
100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm | |
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) | Nikon | ||
Matlab | MathWorks | ||
Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18mm coverslip, #1.5 |
Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
Lipofectamin 3000(transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
EGTA | Sigma | 3780 | |
NH4Cl | Sigma | A0171 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
CaCl2*2H2O | Sigma | 223506 | |
MgCl2*6H2O | Sigma | M9272 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |