Articolo metodologico

Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

DOI:

10.3791/54466

⸱

15 ottobre 2016

 , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison

In questo articolo

Sommario

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PI (4,5) P2 regola diverse funzioni cellulari, ma la sua organizzazione su scala nanometrica nella membrana plasmatica delle cellule è poco conosciuta. Etichettando PI (4,5) P2 con una sonda fluorescente a due colori fusa al dominio Pleckstrin omologia, si descrive un nuovo approccio per studiare il PI (4,5) P2 distribuzione spaziale nella membrana plasmatica su scala nanometrica .

Abstract

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I fosfoinositidi nella membrana cellulare sono lipidi di segnalazione con molteplici funzioni cellulari. Il fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI(4,5)P2) è un fosfoinositide determinante della membrana plasmatica (PM) ed è necessario per modulare i canali ionici, la dinamica dell'actina, l'esocitosi, l'endocitosi, la segnalazione intracellulare e molti altri processi cellulari. Tuttavia, l'organizzazione spaziale di PI(4,5)P2 nel PM è controversa e la sua distribuzione su scala nanometrica è scarsamente compresa a causa delle limitazioni tecniche degli approcci di ricerca. Qui, utilizzando la microscopia di localizzazione di una singola molecola e le sonde fluorescenti a doppio colore basate sul dominio Pleckstrin Homology (PH), descriviamo un nuovo metodo per visualizzare la distribuzione su scala nanometrica di PI(4,5)P2 nel PM in fogli di membrana fissi e cellule vive.

Introduzione

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Fosfoinositidi contribuiscono ad una piccola porzione dei lipidi totali di membrana, ma giocano ruoli critici in una varietà di processi cellulari. Essi comprendono sette membri derivati da fosforilazione reversibile o defosforilazione degli anelli inositolo il 3, 4 ° e 5 ° posizione 1. Phosphatidylinositol 4-fosfato (PI4P) e fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P2) sono due importanti fosfoinositidi che funzionano in modo relativamente indipendente come i lipidi determinante della membrana plasmatica delle cellule (PM) 2,3. Fosfatidilinositolo (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) è molto meno abbondante rispetto PI4P e PI (4,5) P2, ma ha funzioni esclusive situate in diversi processi cellulari tra cui il cancro e il diabete 4 5. Questi lipidi sono interazioni molecolari complesse con i loro effettori e molte altre proteine. Pertanto, è fondamentale per comprendere l'organizzazione spaziale di questi phosphoinositides nel PM su scala nanometrica.

Prove di montaggio ha dimostrato che i complessi proteici o cluster molecola nelle aree PM ristretti possono servire come un segnale hotspot 6. Ad esempio, syntaxin 1a, una proteina chiave che regola la fusione delle membrane 7-9, visualizza organizzazione cluster nel PM. Distinto dal punto di vista del consenso dell'organizzazione gruppo di syntaxin 1a, la distribuzione spaziale della fosfoinositidi nel PM è controversa. Modelli di distribuzione PI (4,5) P2 vanno da uniforme 10-12, grandi macchie 13,14, a densi ammassi 14-18, a seconda del tipo di cellule e dei metodi sperimentali utilizzati. L'organizzazione spaziale di PI (4,5) P2 a più alta risoluzione è anche incoerente. Uno studio utilizzando stimolata emissione-deplezione (STED) microscopia 19 ha rivelato un gran numero di denso PI (4,5) P 2 nano-cluster (~ 73 nm di diametro) in fogli PM del PC-12 celle 20 . Questo risultato è diverso da studi che utilizzano la microscopia congelamento rapido elettronica (EM) 21,22, un approccio che conserva la struttura intatta PM di cellule vive molto meglio di fissaggio chimico. Quest'ultimo ha mostrato pool distinti di PI (4,5) P2; PI relativamente concentrato (4,5) P 2 in caveolae e rivestiti pozzi nonché distribuzione uniforme sulla regione PM piatta. Inoltre, PI scala nanometrica (4,5) P 2 organizzazione in fogli di membrana può differire in cellule vive e fissi. Il nostro recente lavoro ha studiato questo problema nelle cellule sia fisse e vivere INS-1 utilizzando singola molecola di localizzazione microscopia (SMLM) 23.

SMLM si riferiscono al stocasticamente accendere solo un piccolo sottoinsieme di fluorofori in ogni momento in modo che i singoli fluorofori possono essere localizzati con alta precisione. Molti approcci di imaging super-risoluzione sono stati sviluppati usando principi simili a superare il limite di diffrazione di microscopia ottica convenzionale, come uns fotoattivazione localizzazione microscopia (PALM) 24, a fluorescenza fotoattivazione localizzazione microscopia (FPALM) 25, stocastico ricostruzione microscopia ottica (Storm) 26,27 e la tempesta diretta (dSTORM) 28. Con foto-commutabile o fluorofori fotoattivabile (coloranti o proteine fluorescenti), tecniche di SMLM permettono agli scienziati di strutture biologiche di immagini a risoluzione nanometrica 24,29,30 con il video-rate nelle cellule viventi 31,32.

Utilizzando PI (4,5) P2 a titolo di esempio, abbiamo introdotto l'approccio SMLM per studiare la distribuzione su scala nanometrica di fosfoinositidi sul PM. Il dominio PH di PLCδ1 (fosfolipasi C δ1) che si lega specificamente a PI (4,5) P2 è una sonda consolidata per l'imaging PI (4,5) P2 sub-cellulare di distribuzione e la dinamica 33,34 nel PM . Abbiamo geneticamente etichettato questo dominio con due proteine fluorescenti, PAmCherry1 35 e 36 IRFP per la produzione di un dual-colore proteina di fusione (IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (Figura 1A-B). PAmCherry1 funge da sonda fotoattivabile di dominio PH per Palm e IRFP serve come un indicatore generale per identificare le cellule trasfettate prima dell'acquisizione PALM . Applichiamo questa sonda fluorescente a due colori per l'imaging SMLM nei fogli di membrana fissi. Per l'imaging PALM vivo, abbiamo tagged mEOS3 37 anziché PAmCherry1 al dominio PH PLCδ1 per generare la sonda PLCδ1 mEOS3.1-PH per la migliore efficienza fotoni e la luminosità (Figura 1C-D).

Imaging SMLM con queste nuove sonde nel PM di secernono insulina cellule INS-1 38 ha scoperto etichettatura omogenea di PI (4,5) P 2 nella maggior parte delle regioni PM e PI concentrato (4,5) P 2 microdomini che sono scarsamente mescolati nel PM piatto e alcune strutture filopodi simile 23. il nala distribuzione noScale di PI (4,5) P2 offre una base strutturale per ripensare come funziona nelle cellule viventi.

Protocollo

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1. Scheda membrana Preparazione e fissaggio

  1. Preparare fogli di membrana etichettati con IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1
    1. Preparare il DNA codifica plasmide IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 utilizzando tecniche standard di biologia molecolare.
    2. Cultura INS-1 le cellule su # 1.5 18 mm coprioggetto tondo pre-rivestito con 30 ug / ml fibronectina al 50-70% di confluenza seguente INS-1 protocolli standard di coltura cellulare 38,39. Trasfezione delle cellule un giorno dopo viene raggiunto dal 50 al 70% di confluenza.
    3. Cellule trasfezione con IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 utilizzando liposomi reagente di trasfezione seguendo protocolli del produttore. Dopo trasfezione, permettono alle cellule di crescere per 48 ore.
    4. Il giorno dell'esperimento, coprioggetto cappotto (su un lato) con ~ 0.5 - 1 ml della 500 ug / ml poli-D-lisina (PDL, diluiti in dH 2 O) per 1-2 ore. Poi scolare PDL mettendo un carta velina suil bordo del vetrino. Posizionare i coprioggetti su una (C 4 °) piastra metallica pre-raffreddata per un uso successivo.
    5. Lavare pre-transfettate cellule INS-1 che crescono su vetrini con ~ 0,5-1 ml ghiacciata PBS (PBS) contenente 1 mM EGTA. Ripetere il lavaggio tre volte e scarico PBS.
    6. Posizionare il coprioggetto con cellule in coltura (cella sul lato rivolto verso il basso) sui vetrini PDL-rivestito su una lastra di metallo pre-raffreddata con un paio di pinzette. Lasciare il piatto in frigorifero (4 ° C) per 7 - 10 minuti per consentire alle cellule di allegare ai vetrini PDL rivestite (Figura 2).
      NOTA: Il tempo di incubazione dovrebbe essere nell'intervallo di 7 - 10 min per una migliore attacco delle cellule alla superficie PDL rivestite. L'ambiente frigorifero è asciutto e incubazione non dovrebbe essere troppo lungo.
    7. Rimuovere la piastra metallica dal frigorifero. Delicatamente staccare il vetrino contenente le cellule pre-trasfettate con una pinzetta. Questo produce un sottile strato di foglio di membrana cellulare sullavetrino PDL-rivestito. lavare delicatamente i fogli di membrana con ~ 0,5-1 ml ghiacciata PBS e poi fissare con ~ 0,5-1 ml ghiacciata% paraformaldeide 4 (PFA) + 0,2% glutaraldeide (GA) in PBS per 15 minuti a 4 ° C.
      Attenzione: Paraformaldeide e glutaraldeide sono tossici. gestirli in una cappa aspirante con la pelle e protezione per gli occhi.
    8. Dopo la fissazione, l'immagine dei fogli di membrana immediatamente (vedere paragrafo 3) o conservare in ~ 0,5-1 ml di PBS a 4 ° C.
      NOTA: Dopo aver sistemato il foglio di membrana, non ci sarà alcun legame di sonde PH dal citoplasma al PI (4,5) P2 equilibrio. Le sonde PH legati gradualmente dissociarsi dal foglio di membrana e diffondere nella soluzione (anche se potrebbe richiedere giorni o settimane). Pertanto, si raccomanda di immagine i campioni fissati subito dopo la preparazione del campione.
  2. Preparare fogli di membrana per PI (4,5) P2 specifica etichettatura degli anticorpi
    1. Cultura INS-1 celle # 1.5, 18 mm coprioggetto tondo pre-rivestito con 30 &# 181; g / ml fibronectina al 50% -70% di confluenza. cellule trasfezione con DNA plasmidico il giorno successivo come descritto al punto 1.1.3.
    2. Ripetere i passaggi da 1.1.4 a 1.1.7 come descritto sopra.
      NOTA: Eseguire le seguenti procedure a 4 ° C.
    3. Lavare i coprioggetti contenenti fogli PM fisse per tre volte con ~ 0,5-1 ml ghiacciata PBS contenente 50 mM NH 4 Cl. Placare i fogli con ~ 0,5 - boroidruro di sodio 1 ml di 0,1% in PBS per 7 minuti, e lavare con ~ 0,5 - 1 ml di PBS (senza 50 mM NH 4 Cl).
    4. Bloccare i campioni con ~ 0,5 - 1 ml soluzione bloccante (soluzione PBS contenente 5% (v / v) di siero normale di capra, 5% (v / v) albumina di siero bovino e 50 mM NH 4 Cl) per 45 min. Poi, incubare con ~ 0,5 - 1 ml PI primario (4,5) P 2 anticorpo (1: 300 diluizione) in soluzione bloccante per 1 ora. Lavare tre volte (10 min) di volta in volta con ~ 0,5 - 1 ml di PBS contenente 50 mM NH 4 Cl.
    5. Incubare i campioni con ~ 0,5 - 1 ml secondaria F (ab ') 2-capra-anti-topoanticorpi coniugati con fluorofori (1: 300) in tampone di bloccaggio per 1 ora. Lavare tre volte con ~ 0,5-1 ml di PBS.
    6. campioni post-fix 4% PFA + 0,2% GA per 15 minuti, poi lavare campioni tre volte con PBS (7 min ogni volta). Procedere alla Sezione 3 per l'imaging o conservare in ~ 0,5 ~ 1 ml di PBS a 4 ° C per un uso successivo.
      NOTA: Preparare i campioni a 4 ° C. Utilizzare 4% PFA + 0,2% GA fissativo per preservare la distribuzione fisiologica del fosfoinositidi nel PM. RT preparazione o di fissazione con 4% PFA sola possono causare artefatti significativi (Figura 4).

2. Preparazione coltura cellulare per live-cell imaging con mEOS3.1-PH PLC δ1

  1. Preparare il plasmide DNA codificante il δ1 mEOS3.1-PH PLC come descritto in precedenza 23.
  2. Cultura INS-1 le cellule su # 1.5 18 millimetri rotonda coprioggetto pre-rivestita con 30 ug / ml di fibronectina fino a raggiungere il 50% -70% ConfLuency seguente INS-1 protocolli standard di coltura cellulare 38,39.
  3. Il giorno seguente, trasfezione le cellule INS-1 con il mEOS3.1-PH PLC δ1 plasmide DNA utilizzando liposomi reagente di trasfezione seguendo il protocollo del produttore. Incubare per 48 ore prima di imaging.

3. PALM Acquisizione di immagini di fogli di membrana e cellule vive

  1. PALM acquisizione di immagini di fogli di membrana
    NOTA: Qui, una riflessione di fluorescenza interna (TIRF) sistema basato SMLM microscopio totale (olio 100X, APO, NA = 1,49, WD 0,12 millimetri) 23 viene utilizzato per tutti l'acquisizione delle immagini.
    1. Prima di imaging, diluire 1 ml di soluzione di perline fluorescenti in 10 ml di PBS + 50 mM MgCl 2. Aggiungere 200 ml diluito soluzione nei campioni di cellule contenenti camera di imaging (da passaggi 1.1.8 / 1.2.6) per 10 min. Poi, lavare con PBS per tre volte.
    2. Avviare il sistema di imaging PALM. Nel software di imaging associato, selezionare il "canale IRFP &# 34; tasto (642 nm laser di eccitazione, 700/75 nm di emissione). Trova la membrana cellulare che esprime sonde PH nel canale IRFP.
      NOTA: Il foglio membrana deve avere un tallone fluorescente nelle vicinanze. Questo è necessario per la correzione della deriva tardi.
    3. Utilizzare il pulsante "cattura" per raccogliere un'immagine TIRF convenzionale della membrana cellulare in canale IRFP come riferimento per la futura ricostruzione dell'immagine. Impostare un angolo TIRF normale (vale a dire, dopo aver raggiunto l'angolo critico, girare un altro 1,5 gradi) digitando nel 2140 in un angolo TIRF impostazione per l'imaging. Utilizzare questa impostazione per tutte le fasi, salvo diversa indicazione angolo.
      NOTA: Nel sistema TIRF qui descritto, 3500 è l'angolo verticale fino, 2200 è l'angolo critico TIRF e 2140 è l'angolo TIRF normale, che è 1,5 gradi più dopo TIRF angolo critico. L'angolo TIRF stretto di seguito indicate in 3.2.3 è 2120, che è un altro 2 gradi dopo aver raggiunto TIRF angolo critico.
    4. Passare al canale PAmCherry1 cliccando °pulsante del canale RFP e (561 nm di eccitazione, 600/50 filtro per le emissioni nm). Regolare la barra di scorrimento nel pad "AOTF" tutta la strada per il diritto di avere il potere di illuminazione piena di laser 561 nm per 10-20 secondi per sbiancare la fluorescenza di fondo membrana.
    5. Impostare l'impostazione ottimale della telecamera (binning 2x2) nella scheda "Formato" e il protocollo di acquisizione veloce nella scheda "acquisizione sequenza ND" (tipicamente 10,000-40,000 immagini a 20 Hz).
    6. Inizia l'acquisizione di immagini PAmCherry1 (561 nm laser a piena potenza, 50 msec / telaio) con contestuale attivazione del laser 405 nm ad un livello basso (0,1% - 1%), facendo clic sul pulsante "Esegui ora". Regolare l'intensità del laser 405 nm in modo che spazialmente isolati singoli punti in ogni frame sono facilmente identificabili.
      NOTA: Il numero di molecole PAmCherry1 attivabili diminuisce gradualmente durante l'acquisizione. 405 nm intensità del laser dovrebbe essere gradualmente aumentata per mantenere la densità ottimale dei singoli segnali molecola in ciascunatelaio.
    7. Continuare fino a quando l'acquisizione di immagini viene attivato alcun segnale PAmCherry1 singola molecola.
  2. l'imaging PALM in cellule vive
    1. Prima di imaging, diluire perline fluorescenti nella camera di imaging per 10 minuti come descritto al punto 3.1.1. Quindi avviare l'imaging PALM aprendo il software di imaging associato.
      NOTA: Utilizzare un magnetico a sgancio rapido camera di imaging per l'imaging dal vivo di cellule. Mantenere il centro del campo dell'imaging a 35 ° C con un regolatore di temperatura sotto costante perfusione con tampone extracellulare (extracellulare Soluzione: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl 2, 1.2 mM MgCl 2, 3 mM di glucosio, e 20 mM HEPES, pH = 7.3).
    2. Scegliere il pulsante del canale GFP (525/50 nm di emissione). Identificare la membrana cellulare che esprime sonde fluorescenti in base fluorescente verde da mEOS3 sotto 488 nm eccitazione laser. Assicurarsi che perline fluorescenti nelle vicinanze sono inclusi anche durante l'imaging come questo sono necessari in seguito per dri in lineaCorrezione ft.
    3. Fare clic sul pulsante "Capture" per raccogliere un'immagine TIRF della membrana cellulare in mEOS3 (verde) canale come immagine di riferimento. Utilizzare un superficiale evanescente illuminazione d'onda di eccitazione (dopo aver raggiunto l'angolo critico, girare un altro 2 gradi) digitando nel 2120 in un angolo TIRF impostazione per l'imaging dal vivo di cellule.
      NOTA: Questo minimizza la fluorescenza dal non legato mEos3-PH nella adiacente citosol alla membrana plasmatica.
    4. Passare al "canale di RFP" pulsante (561 nm di eccitazione, 600/50 nm di emissione). Utilizzare la piena potenza del laser 561 nm di candeggina fluorescenza di fondo dei fogli di membrana per 10 ~ 20 sec con la barra di scorrimento nella "pad AOTF" (vedi 3.1.4).
    5. Inizia l'acquisizione di immagini facendo clic sul pulsante "Esegui ora" nel canale rosso (561 nm piena potenza, fissato a 10 msec / frame nella "camera" impostazione scheda), con contestuale attivazione del laser 405 nm. Regolare l'intensità del laser 405 nm per attivare punti spazialmente separatiin ogni frame.
      NOTA: Come procede di acquisizione, un convertito mEOS3.1-PH PLC δ1 numero molecola diminuisce lentamente. Aumentare gradualmente la potenza del laser 405 nm per ottimizzare il segnale singola molecola. La lunghezza acquisizione immagini dipende dallo scopo sperimentale. Acquisire immagini in modo continuo per 5 minuti in condizioni normali. Se è necessaria una acquisizione più lungo, raccogliere più pile di immagini al posto di un unico, grande serie di immagini. La dimensione del file di ogni pila di immagini non deve superare i 4 GB o interesserà l'analisi del software in seguito.

4. SMLM Image Processing e la ricostruzione

  1. Trasferire i file di immagine (.tif immagine pile) a una stazione di analisi delle immagini. Avviare il programma di ricostruzione delle immagini (su scritta) in Matlab come descritto in precedenza 37 e caricare la pila di immagini facendo clic sulla scheda "File" nel menu principale, quindi "aperto", quindi "nuovo file".
  2. Identificare e LocaLize singoli eventi molecolari da ogni fotogramma. Impostare filtraggio soglia intensità con un numero di soglia (1-10) nella "wavelet". Verificare le impostazioni dei parametri ottimali per il rilevamento punto visivamente prima della ricostruzione. Poi vai alla scheda "PALM" e fare clic su "un processo graduale" per avviare la ricostruzione delle immagini.
    NOTA: soglia di intensità per la rilevazione punto è arbitraria e dipende dall'esperienza personale. Diversi studi può essere richiesto di generare una soglia di rilevamento ottimale che ne raccoglie troppi non qualificato (dim) punti e dell'elemento filtrante troppo molti punti qualificati (chiaro). Regolare gli altri parametri per ottimizzare l'analisi dei dati. Qui, la distanza quartiere (punti di fluorescenza nei fotogrammi vicini all'interno di una distanza vengono combinati) è impostato come 65 nanometri (1/2 larghezza in pixel) e montato come una singola molecola. telai Gap (eventi singoli molecola che si sono verificati all'interno di queste cornici e quartiere distanza sono stati combinati e montato come un singolo evento molecola) èimpostato come 26 fotogrammi (1,3 sec) per l'imaging PAmCherry1 40. Regolare questi parametri in base alle proprietà di sonde di singola molecola e la velocità di acquisizione per evitare un eccesso di conteggio 40 in SMLM. Applicare correzione della deriva con perline fluorescenti durante le ricostruzioni.
    1. Per l'imaging i fogli di membrana fissi etichettati da IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, ricostruire l'intero stack di immagini provenienti dallo stesso foglio di membrana di una singola immagine super-risoluzione 37 in.
    2. Per campioni di cellule vive etichettati da mEOS3.1-PH PLC δ1, separano l'intera pila di immagini in diversi piccoli stack di 1.000 fotogrammi in modo che pila 1,000 consecutivi-frame viene ricostruita come immagine super-risoluzione singolo, che ha una risoluzione temporale 10 sec. Alla fine, combinare tutte le immagini serie temporali nella serie pila tempo finale 23.
      NOTA: In immagini PALM live-cella, un piccolo numero di sonde attivati ​​può muovere o dissociarsida PI (4,5) P 2 nel PM prima sbianca. Per spiegare il sovracampionamento delle sonde, si combinano i segnali singola molecola nei fotogrammi vicini all'interno di 130 nm (invece di 65 nm) in un unico evento di emissione durante l'analisi delle immagini.
  3. Dopo aver ottenuto le immagini ricostruite, effettuare ulteriori analisi di immagine con il programma personalizzato scritto in Matlab per quantificare la densità molecola, la densità micro-dominio / dimensioni, e l'analisi cluster con coppia di correlazione 41.

Risultati

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L'incertezza di localizzazione (σ) del nostro sistema di super-risoluzione è di 14.73 nm 23. Confronti diretti tra TIRF e immagini PALM dimostrato un significativo miglioramento della risoluzione spaziale. Figura 3A-B mostra il PI rappresentante (4,5) P 2 immagini TIRF etichettati con PI (4,5) P2 anticorpi e IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 in fogli tipici membrana e cellule vive. Le immagini con la microscopia TIRF convenzionale in fogli di membrana sono molto simili a quelle in cellule vive intatte etichettati con la proteina fluorescente verde maggiore (EGFP) tagged domini PH (EGFP-PH PLCδ1) (Figura 3C). Tutti i campioni hanno mostrato una distribuzione uniforme di sonde. Al contrario, la fissazione non ottimale dei campioni provocato PI densa tagliente (4,5) P 2 grappoli e una diminuzione dell'intensità del segnale (figura 4). In condizioni ottimali di fissaggio, tsi immagini super-risoluzione di PI (4,5) P 2 in cellule fissate (Figura 5) ha rivelato una distribuzione omogenea di sonde in una porzione significativa del PM con solo gradienti di concentrazione limitato. Alcune patch di membrana arricchiti di PI (4,5) P 2 sonde sono state scarsamente distribuito e aveva varie dimensioni. Cellule vive immagini PALM mostrano una distribuzione spaziale simile a cellule fissate (Figura 6). L'analisi dettagliata di PI (4,5) P 2 segnali oltre i risultati di orario a dinamiche veloci in aree locali, senza variazioni significative della loro abbondanza in vaste aree.

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Figura 1. Schema di sonde fluorescenti utilizzati in questo studio. Sonda (AB) IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 utilizzato negli esperimenti foglio membrana fissi. Durante l'imaging TIRF convenzionale (A), una 640 nm laser viene utilizzato per eccitare il IRFP (Es: 692 nm; em: 713 nm). Immagine TIRF preso in questa condizione serve come immagine di riferimento per TIRF imaging super-risoluzione ottenuta mediante imaging PALM (B). Un laser 405 nm viene utilizzata per foto-attivare il fluoroforo PAmCherry1 e un laser 561 nm viene utilizzato per eccitare PAmCherry1 (Es: 564 nm; em: 595 nm) per l'imaging PALM. (CD) Sonda PLCδ1 mEos3.1-PH utilizzato negli esperimenti cellule vive. (C) durante l'imaging TIRF convenzionale, un laser a 488 nm viene utilizzato per eccitare mEOS3.1 (Es: 506 nm; em: 519 nm). (D) Dopo fotoconversione da un laser 405 nm, mEos3.1 si trasforma in forma rosso (Es: 573 nm; em: 584 nm). E un laser a 561 nm viene utilizzato per le acquisizioni PALM Cliccate qui per vedere una versione più grande questa figura.

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Figura 2. Schema per la preparazione del foglio di membrana da INS-1 le cellule. (A) Posizionare il vetrino con cellule in coltura rivolti verso il basso su un vetrino PDL rivestite e attendere 7 ~ 10 minuti a 4 ° C per permettere l'adesione delle cellule al PDL- vetrino rivestito. (B) Staccare il vetrino superiore con una pinzetta e fissare il foglio di membrana collegata al PDL coprioggetto pre-rivestito. (C) L'immagine dei campioni con TIRFM e palme. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. PI (4,5) P 2 organizzazione spaziale è simile tra fogli di membrana e cellule vive intatte al microscopio TIRF convenzionale. (A) Atipica immagine TIRF di fogli di membrana fissata al 4 ° C con 4% PFA e 0,2% GA. PI (4,5) P2 è stato etichettato con PI (4,5) P2 anticorpo specifico. (B) Un foglio di membrana dalla cella INS-1 che esprimono IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. Immagine (C) TIRF delle due cellule vive intatte che esprimono EGFP-PH PLCδ1 a diversi livelli. Barre di scala: (A): 3 m; (B) e (C):. 5 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. PI (4,5) P 2 organizzazione spaziale in fogli di membrana è sensibile alle condizioni di fissazione comuni. (A) fogli di membrana fissata a 37 ° C con 4% PFA solae marcato con PI (4,5) P 2 anticorpo specifico (come nella Figura 3A). Strato (B) membrana fissata a RT con sola PFA ed etichettato con PI (4,5) P 2 anticorpo specifico. Si noti che i densi ammassi di PI (4,5) P 2 sonde sono chiaramente visibili sotto TIRF microscopio, in contrasto con le molto più anche immagini di fluorescenza mostrati nella Figura 3A. Barre di scala: AB:. 3 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura di imaging 5. palmo della PI (4,5) P 2 sonde rivela la loro distribuzione su scala nanometrica in un PM INS-1 delle cellule. (A) IRFP TIRF immagine di un foglio di membrana da una cellula INS-1 che esprimono IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) immagine Palma di PM corrispondente nella stessa regione sulla base di ricostruzione del segnale PAmCherry1. Si noti il PI omogeneo (4,5) P 2 distribuzione spaziale nelle principali regioni pm e diversi PI (4,5) P 2 microdomini. (C) una vista ingrandita della zona di scatola in (B). Le frecce indicano scarsamente distribuiti microdomini PM arricchite con PI (4,5) P 2 sonde. Barre di scala: A e B: 3 micron; C: 500 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura di imaging 6. PALM in vivo INS-1 le cellule. (A) immagine TIRF di PI (4,5) P2 in un live INS-1 delle cellule che esprimono mEos3.1-PH PLCδ1. L'immagine è stata acquisita rapidamente nel canale verde prima acquisizione PALM (35 ° C). (B) live-cell immagini sequenziali di palma a 10 intervalli sec. Insets mostrano i profili di intensità della PI locale (4,5) P 2 densità lungo la stessa retta 1 posizione in tempi diversi in (B) e (C). Nota loro grandi variazioni di intensità locali entro 10 sec. (D) Tempo corso delle variazioni medie di intensità di PI (4,5) P 2 nella grande area (box2, 3x3 micron) e piccoli cerchi (3, 4, e 5, 500 nm di diametro) in (B) durante 5 min di immagini PALM (frame / 10 sec). Si notino le fluttuazioni di intensità rapidi di PI locale (4,5) P 2 sonde (cerchio 3, 4 e 5) rispetto a piccolissime variazioni della vasta area (riquadro 2). Immagini (E) ingrandita palmo della regione box2 a (B), a volte indicato. Le frecce indicano (4,5) P 2 di membrana arricchiti PI sotto pcondizioni hysiological. Barre di scala: C: 3 micron; E: 500 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Per la risoluzione dei problemi, due processi hanno bisogno di attenzione in più: la produzione di fogli di membrana e la fissazione del campione. Come descritto nel protocollo, il tempo di incubazione dei vetrini al punto 1.1.6 è importante per la produzione di fogli di membrana. Tempo di incubazione ottimale sotto la nostra condizione sperimentale è 7-10 min (Figura 2). Più di 10 min di incubazione produrrà cellule intatte invece dei fogli di membrana su vetrini PDL e di incubazione più breve porterà a meno o nessun fogli di membrana sui vetrini PDL-rivestite. Come descritto nel protocollo, i fissativi e la temperatura durante la fissazione sono fondamentali per il mantenimento della PI (4,5) Distribuzione P 2 nel PM. Fissazione a temperatura ambiente o l'uso del solo 4% -PFA potrebbero distorcere la distribuzione normale dei lipidi nel PM.

Applicando la microscopia PALM alla membrana lipidica di ricerca, siamo in grado di osservare la distribuzione scala nanometrica di PI (4,5) P2, un phosphoinositide chiave che media mtutte le attività cellulari fondamentali. Questa distribuzione spaziale di PI (4,5) P2 con gradienti di concentrazione limitati in INS-1 le cellule fornisce un quadro per ripensare le interazioni lipidi-proteine e gli eventi di segnalazione locali di PI (4,5) P2 in queste cellule. Inoltre, i metodi sviluppati in questo lavoro possono essere applicati anche ad altre ricerche fosfolipidi di membrana con sonde adeguate, in tal modo, offrendo nuovi strumenti per studiare fosfoinositidi nei processi biologici.

L'uso di fogli di membrana in questo lavoro bypassa due principali preoccupazioni negli studi morfologici fosfolipidi: trattamento detergente e il potenziale di contaminazione del segnale dal citoplasma. I detersivi sono spesso causa di clustering e significativa perdita di segnale PM fosfolipidi. La contaminazione del segnale citosolico è particolarmente problematico nel caso di basse fosfoinositidi abbondanza sulla PM 23, come PI (3,4,5) P 3 e PI (3,4) P 2. campioni foglio di membrana sono in grado di Circumvent questi problemi senza interrompere significativamente strutture associate con la membrana plasmatica, come corticale reticolo actina e pozzi clathrin rivestite 42,43. La distribuzione omogenea relativa del PI (4,5) P2 nel PM è in buon accordo con altri studi di congelamento rapido EM utilizzando sonde δ1 GST-PH PLC nella membrana dei fibroblasti 44.

E 'importante notare che le condizioni di trattamento dei campioni impropri possono generare risultati fuorvianti. Innanzitutto, è fondamentale per eseguire le operazioni di fissaggio ad una temperatura inferiore (4 ° C) e usare il fissativo GA per la produzione di fogli di membrana. Come mostrato in figura 3, temperatura calda e fissazione PFA senza GA non è sufficiente fissare fosfoinositidi in PM cellule. Questo potrebbe distorcere il PI intatto (4,5) P 2 di distribuzione e generare cluster taglienti che non sono osservati in cellule vive in condizioni fisiologiche. In secondo luogo, l'uso di PAmCherry1 comela sonda SMLM, piuttosto che altre sonde, è fondamentale per l'imaging PALM quantitativa. Il beneficio dell'applicazione PAmCherry1 proviene da sue singole foto-fisiche molecolari ben caratterizzati 35,40,45, quali luminosità, alta efficienza fotoattivazione e soprattutto, molto limitato foto-lampeggiante. Queste proprietà ci permettono di eliminare potenziali artefatti cluster da foto-lampeggiare e quantitativamente analizzare la densità molecolare di PI membrana (4,5) P 2.

Questo approccio ha anche i suoi limiti. Innanzitutto, il metodo foglio membrana utilizzata in questo studio non può simulare perfettamente la distribuzione fisiologica di PI (4,5) P 2 perché la cella viene interrotto prima di imaging. Tuttavia, il nostro l'imaging dal vivo PALM mostra simile distribuzione relativamente omogenea di PI (4,5) P2, sostenendo i risultati osservati con i campioni foglio membrana. In secondo luogo, come abbiamo discusso nel nostro precedente lavoro 23, SMLM richiede competenze di imaging e in più atenzione per evitare artefatti di imaging che potrebbero derivare da diversi processi, tra cui le sonde utilizzate, preparazione del campione e di fissazione, di campionamento di immagine e di ricostruzione. Infine, se sonde e anticorpi basato il dominio PH sono stati ampiamente utilizzati in studi fosfoinositide 46,47 rimane possibile che non tutte PI (4,5) P 2 nella membrana può essere rilevato da questo approccio. Ad esempio, PI (4,5) P 2 vincolato da altre proteine endogene potrebbe non essere accessibile a sonde pH o anticorpi, e questo può causare una sottostima della PI (4,5) P 2 causa l'ostacolo spazio di sonda stessi. Un modo alternativo di etichettatura PI (4,5) P 2 sarebbe utilizzando Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, un PI pre-marcato (4,5) P 2 analogico con una modifica sulla coda originale PI (4,5) P 2. Tuttavia, può essere convertito rapidamente in altri sottotipi di fosfoinositide veloce metabolismo cellulare in diretta dal suo anello inositolo è lo stesso di endogenous PI (4,5) P 2. Ciò solleva la preoccupazione se questo PI pre-marcato (4,5) P 2 analogici in cellule vive può rappresentare fedelmente PI (4,5) P2, piuttosto che i suoi prodotti metabolici. Pertanto, nonostante alcune limitazioni, le sonde a base di dominio PH sono ancora tra i migliori sonde che sono stati ampiamente utilizzati per monitorare la distribuzione PI (4,5) P2 e dinamiche sul PM delle cellule.

La futura di tale metodologia può essere estesa ad altri studi fosfoinositide, come PI (3,4,5) P 3 e PI (3,4) P 2. In sintesi, l'approccio SMLM romanzo qui utilizzato apre nuovi modi di studiare phosphoinositide nelle cellule. Utilizzando PI (4,5) P 2 come esempio, dimostriamo le proprietà uniche dell'imaging PALM nello studio morfologico e quantitativa di molecole di membrana cellulare, così come i suoi svantaggi. Questo approccio può essere adattato ad altre molecole di interesse ed avrà ampie applicazioni in biologia cellulare.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. è parzialmente supportato dalla borsa di studio pre-dottorato American Heart Associate (14PRE20380168, a C.J.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MicroscopioNikonTi-U
sCMOS fotocameraAndorNeo
Disco rotanteYokogawaCSU X-1, 10.000 giri/min
Combinatore laser monolitico ad alta potenza SP con laser a 405, 488, 561 e 642 nm.Potenze originali del laser AgilentMLC400e potenze all'estremità della fibra ottica)
405  nm: 15 mW & 13  Mw;
488  nm: 45 mW & 42  Mw;
561  nm: 45 mW & 40  Mw;
640  nm: 35 mW & 16  Mw.
Obiettivo 100XNikonAPO 100X Olio, NA 1.49, WD 0.12  mm
Software di acquisizione e analisi Nikon (NIS Element)Nikon
MatlabMathWorks
CoverslipWarner64-0714Round 18  mm vetrino coprioggetti, #1.5
FibronectinaMilliporeFC010-5MG
Lipofectamin 3000 (reagente di trasfezione)InvitrogenL3000-008
Microscopia elettronicaglutaraldeide#16120
PI(4,5)P2 1st anticorpoSanta Cruzsc-53412
anticorpo secondario  F(ab')2-capra-anti-topo Alexa Fluor 647InvitrogenA-21237
Perline Tetraspeck Camera di imaging magneticaInvitrogenT7279
nbsp;Warner InstrumentsCat#641994
Warner InstrumentsTC-344C
Poly-D-LysineSigmaP6407
Soluzione salina tampone fosfatoSigmaP4417-100TAB
EGTASigma3780
NH4ClSigmaA0171
Siero di capraSigmaG9023
albumina sierica bovinaSigmaA7906
NaClSigmaS5886
KClSigmaP5405
CaCl2• 2H2OSigma223506
MgCl2• 6H2OSigmaM9272
GlucosioSigmaG7021
HEPESSigmaH4034
ParaformaldiideSigmaP6148
a Scienza a sgancio rapido & Regolatore di temperatura

Riferimenti

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