Eine Kapillare-basierte Immunoassay mit einer kommerziellen Plattform zu Zielproteine von Gesamtprotein Vorbereitungen messen wird demonstriert. Darüber hinaus sind Assay Parametern Belichtungszeit, Proteinkonzentration und Antikörper-Verdünnung für ein Zellkultursystem Modell optimiert.
Neue Technologien, die Kapillare-basierten Immunoassays nutzen Versprechen Protein schneller und mehr quantitative Bewertung im Vergleich zu traditionellen Immunoassays. Ist jedoch ähnlich wie bei anderen Antikörper-basierten Protein-Assays, Optimierung der Kapillare-basierte Immunoassay Parameter, z. B. Proteinkonzentration Antikörper Verdünnung und Belichtungszeit eine wichtige Voraussetzung für die Erzeugung von sinnvolle und zuverlässige Daten. Messungen müssen innerhalb des linearen Bereichs des Assays wo sind Veränderungen im Signal direkt proportional zur lysate Konzentrationsänderungen fallen. Der Prozess der Auswahl geeigneter lysate Konzentrationen, Antikörper-Verdünnungen und Belichtungszeiten in der menschlichen bronchialen Epithelzelle Linie, BEAS-2 b, wird hier gezeigt. Assay Linearität wird über einer Strecke der ganzen Zelle Extrakt Proteinkonzentrationen mit p53 und α-Tubulin Antikörper angezeigt. Ein Beispiel für Signal-Burnout ist in den höchsten Konzentrationen mit langen Belichtungszeiten gesehen, und eine α-Tubulin Antikörper Verdünnung Kurve zeigt Sättigung zu demonstrieren. Darüber hinaus sind Beispiel experimentelle Ergebnisse für Doxorubicin-behandelten Zellen mit optimierten Parametern ausgewiesen.
Kapillare elektrophoretischen Immunoassays messen Proteinexpression in Zelle Lysates mit Größe oder Ladung Trennsysteme und bieten mehrere Vorteile gegenüber der traditionellen Immunoassays. Zum Beispiel im Vergleich zu western-Blot das automatisierte Kapillar-basierte Verfahren eliminiert die Notwendigkeit für Gele, Transfer Geräte und Handbuch wäscht. Darüber hinaus ist die absolute Menge an Protein benötigt etwa 10 mal weniger, und Kapillar-basierte Systeme ideal für den Einsatz mit seltenen Zelltypen oder begrenzten Stichprobe1,2. Ergebnisse in weniger als 3 h mit automatisierten Systemen stammen und haben zuvor nachgewiesen, dass mehr quantitative und reproduzierbar als herkömmliche Western blot Verfahren3,4,5. Der Prozess für Größe basierende Assays besteht aus Proben, die Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), Dithiothreitol (DTT), laden und Gewebekulturen beschriftet Molekulargewicht Marker in Kapillarsäulen mit Stapeln und Trennung Matrizen. Spannung an den Kapillaren trennt die Proteine in den Proben je nach Größe und UV-Licht lähmt die getrennten Proteine an der Kapillare Wand. Die Kapillare ist dann Immuno-sondiert mit zielgruppenspezifischer primären Antikörper und Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper. Luminol und Peroxid katalysieren chemiluminescent Lichterzeugung durch eine Ladung gekoppelten Gerät (CCD) Kamera gemessen und analysiert, um Protein quantitate.
Trotz der relativen Leichtigkeit und Geschwindigkeit einer automatisierten Kapillare basierende elektrophoretische Immunoassay-Plattform ist die Optimierung der Assay-Bedingungen wie Proteinkonzentration, Antikörper Verdünnung und Belichtungszeit wichtig für den Erhalt der genaue und reproduzierbare Ergebnisse. Im Allgemeinen sollten die folgenden Verfahren durchgeführt werden, um eine Probe für diese Systeme zu optimieren:
(1) ein Bildschirm sollte durchgeführt werden, zu bewerten und Antikörpern für Signal und Spezifität an das Protein-Ziel zu wählen. Falls verfügbar, kann gereinigtes Protein oder Ziel-Epitop zur Spezifität zu beurteilen; Allerdings ist es noch wichtig zu beurteilen, mögliches unspezifisches Signal in Gesamt-Protein aus dem Modellsystem bezogen.
(2) als nächstes muss der dynamische Bereich des Tests bestimmt werden. In einer idealen Situation ist Signal verdoppeln (mit Peakfläche gemessen) beobachtet, wie Probenkonzentration verdoppelt wird; in der Praxis ist jedoch eine proportionale Veränderung in Signal an Eingang in einer vorhersagbaren Weise (z. B.lineare passen) ausreichend Protein Quantifizierung. Darüber hinaus wird diese Optimierung Proteinkonzentration mit high-Signal, aber noch innerhalb des linearen Bereichs für den experimentellen Modell definieren.
(3) bestimmen Sie die optimale Antikörperkonzentration mit der festen Proteinkonzentration in Optimierungsschritt 2 ausgewählt. Wenn die Antikörperkonzentration zunimmt, nimmt das Signal bis es bei Sättigung Hochebenen. Eine Antikörperkonzentration in der Nähe dieser Sättigungsgrad ist erforderlich für eine genaue Messung der Proteinkonzentration.
Der Prozess zur Optimierung der Proteinkonzentrationen, Antikörper-Verdünnungen und Belichtungszeiten für eine automatisierte Kapillar-basierte Größe Assay6 zeigt sich mit ganze Zelle Extrakten von BEAS-2 b, ein SV-40 verwandelte Mensch bronchiale isoliert epithelialen Zell-Linie. Protein isoliert von Zellen oder Geweben Extrakte kann mit einer Reihe von veröffentlichten Protokolle7,8,9 durchgeführt werden und wird hier nicht behandelt werden. Ergebnisse einer Studie Experiment mit der optimierten Bedingungen sind auch für insgesamt gemeldeten und phosphoryliert (Serin 15, Serin 20) p53 in Kulturen ausgesetzt Doxorubicin (ein gemeinsames Chemotherapeutikum, die Zelle Apoptose10induziert) 1.2, 1.8, und 2,4 µg/mL Medien für 4 h vor der Ernte. Die p53 Peakflächen sind auf ɑ-Tubulin, normalisiert die als laden-Steuerelement verwendet wird.
Es hat seit Jahrzehnten nachhaltiges Interesse an der Entwicklung der Kapillare elektrophoretischen basierende Immunoassay Methoden wegen niedrigem Probe und Reagenz Ausgaben, verringerte Verarbeitung Zeit im Vergleich zu traditionellen Methoden und hohe Kompatibilität zu automatisieren Sie die Prozedur4,15. Es gibt eine Reihe verschiedener Protokolle für die Trennung von Proteinen, die Kapillaren, einschließlich der elektrophoretischen, elektrokinetischen, Polymer Siebung und isoelektrischen Methoden, die Proteine (bzw. durch unterschiedliche Eigenschaften zu isolieren, genutzt haben elektrostatische Aufladung, Partition Gleichgewicht, Siebung Eigenschaften der trennenden Matrix und pH-Wert)16. Hier beschreiben wir ein Antikörper-basierte (oder Immunoassay) Kapillarelektrophorese-Methode, bei der ein Polymer, Siebung, Trennung, die automatisiert worden und kommerziell angenommenen3. Vorteile dieses Systems sind einfache Bedienung und Betrieb, standardisierte und im Handel erhältlichen Reagenzien und zuverlässige, empfindliche Messungen, die weniger Reagenzien und Proben im Vergleich zu traditionellen Protein Assays wie western-Blot erfordern, Enzym-linked Immunoassay und andere Formate3,4,5. Es wurde in vorherigen Bewertungen dieser Technologie festgestellt, dass die Größe des Proteins, die beurteilt werden kann begrenzt wurde durch die verfügbaren Trennung Matrix4, aber den letzten Angebote der messbaren Bereich von 2 bis 440 kDa17 erweitert haben . Darüber hinaus muss einige lysate Puffer für unvereinbar mit dem Assay18bekannt sind, daher Auswahl des experimentellen Reagenzien vorher berücksichtigt werden.
Ein großer Vorteil eines automatisierten Verfahrens mit handelsüblichen Bauteilen ist die Konsistenz der Ergebnisse durch standardisierte Methoden und Reagenzien. Dies minimiert die Chancen der Assay-Ausfall durch die Automatisierung wichtige Schritte im Rahmen des Verfahrens. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass bestimmte Praktiken während des Protokolls, Probleme mit der Kapillare elektrophoretischen basierende Immunoassay zu minimieren eingehalten werden müssen. Erstens ist es wichtig, dass die Luminol-S/Peroxid-Mischung vor Platte laden frisch und sofort bereit ist. Konsequente Timing führt konsequent Lumineszenz nach Oxidationsmittels hinzugefügt wird, das konsequente Messungen für einen bestimmten Antikörper-Assay nach Assay ergibt. Darüber hinaus ist es wichtig, dass nicht abgelaufen Reagenzien verwendet werden, das betrifft vor allem der Potenz des Oxidationsmittels. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Ladereihenfolge der Proben, Antikörper und andere Reagenzien strikt eingehalten werden (siehe Abbildung 1). Jede Reagenz pipettiert fehl am Platz führt Assay scheitern und eine vergeudete laufen.
Neben diese kritischen Schritte können primäre Probleme mit der Technik in der Regel durch Optimierung überwunden werden. In der Tat, diese Bedingungen sind spezifisch für jedes Modell-System/Antikörper-Kombination und sollte daher für jeden neuen Assay empirisch ermittelt werden. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf drei gemeinsame Optimierungsverfahren: Belichtungszeit, lysate Titration und Primärantikörper Verdünnung. Messbare Ergebnisse zu generieren, hängt Analyse eine Belichtungszeit als die Luminol-Substrat nicht rasch, als Substrat Erschöpfung führt zum Verlust des Signals zur Neige gehen wird. Lysate Titration bestimmt den linearen Dynamikbereich jedes Assays, die mit verschiedenen Modellsysteme sowie verschiedene Antikörper, auch für das gleiche Protein-Ziel abweichen können. Antikörper-Verdünnungen gewählt an oder nahe der Sättigung Konzentrationen sorgen für Veränderungen im Signal nicht durch einen Mangel an freien Antikörper, sondern nur durch unterschiedliche Menge an verfügbaren Protein-Ziel-Epitop betroffen sein werden. Andere Überlegungen bei den Optimierungsprozess können Antikörper Inkubationszeit und Stapeln/Probe Ladezeit gehören. In den meisten Fällen bieten die Standardeinstellungen für das Instrument das beste Verhältnis von Auflösung und Empfindlichkeit. Jedoch kann in einigen Fällen schlechte Auflösung und Empfindlichkeit verbessert werden durch diese Parameter anpassen.
Kapillare elektrophoretischen basierende Immunoassay Methoden liefern schnelle, effiziente und reproduzierbare Protein Messungen. Während diese Methoden vor allem in Forschung und Entwicklung Einstellungen verwendet worden sein, hat die Konsistenz dieser Technologien potenzielle Nutzen in regulatorischen und klinische Anwendungen. Beispielsweise kann die Identifizierung von anfälligen Subpopulationen, Umweltgifte oder Patienten mit Fortschreiten der Krankheit auf Protein-Biomarkern gemessen in zugänglichen Matrizen, wie Blut, Urin und Speichel beruhen. Als Reagens und Betrieb Kosten Drop und die Anzahl der Proben und Ziele, die gleichzeitig bewerteten erhöht werden können, sehen wir wahrscheinlich Kapillare elektrophoretischen basierende Immunoassay Methoden für diese Arten von Anwendungen verwendet.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten Keith Tarpley von uns EPA Büro von Forschung und Entwicklung-Research Triangle Park (ORD-RTP) Grafik und Media Team für Entwicklung, Aufzeichnung und Bearbeitung von das Anleitungsvideo zu danken. Wir würden auch gerne Deborah Pritchett aus ProteinSimple Danke für hilfreiche Gespräche zur Optimierung unserer Daten. JM Guynn wurde vom Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Forschung/Teilnahme Education Program der US Environmental Protection Agency unterstützt.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |