介绍了一种基于毛细管的免疫分析方法，利用商业平台从总蛋白样品中检测目标蛋白。此外，针对细胞培养模型系统，优化了曝光时间、蛋白浓度和抗体稀释度等分析参数。
本文内容
摘要
摘要
与传统的免疫测定方法相比，基于毛细管的免疫测定新技术有望实现更快且更定量的蛋白质检测。然而，与其他基于抗体的蛋白质检测方法类似，优化基于毛细管的免疫测定参数（如蛋白质浓度、抗体稀释度和曝光时间）是获得有意义且可靠数据的重要前提。检测信号必须落在测定方法的线性范围内，以确保信号变化与裂解液浓度变化呈直接正比关系。本文以人支气管上皮细胞系 BEAS-2B 为例，演示了如何选择合适的裂解液浓度、抗体稀释度和曝光时间。使用抗 p53 和抗 α-微管蛋白（α-tubulin）抗体，在一系列全细胞提取物蛋白质浓度下展示了检测的线性范围。结果显示，在高浓度条件下延长曝光时间会导致信号饱和（信号烧灼），并展示了 α-微管蛋白抗体的稀释曲线以说明抗体饱和现象。此外，还报告了采用优化参数检测阿霉素处理细胞的示例实验结果。
引言
毛细管电泳免疫分析利用基于分子大小或电荷的分离系统，检测细胞裂解液中的蛋白质表达水平，相较于传统免疫分析方法具有多项优势。例如，与蛋白质印迹法（western blot）相比，基于毛细管的自动化流程无需使用凝胶、转膜装置以及人工洗涤步骤。此外，所需蛋白样品量大约减少至原来的十分之一，使得毛细管系统特别适用于稀有细胞类型或样本量有限的情况1,2。使用自动化系统可在短短3小时内获得结果，且已有研究证明其定量性和重复性优于传统的蛋白质印迹法3,4,5。基于分子大小的分析流程包括：将含有十二烷基硫酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）以及荧光标记的分子量标准品的样品加入毛细管柱中，毛细管内含有浓缩胶和分离胶基质。施加电压后，样品中的蛋白质根据分子大小在毛细管中实现分离，随后通过紫外光将分离后的蛋白质固定于毛细管内壁。接着使用靶标特异性的初级抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的次级抗体对毛细管进行免疫探针反应。鲁米诺和过氧化物催化产生化学发光，发出的光信号由电荷耦合器件（CCD）相机检测，并用于蛋白质的定量分析。
尽管基于毛细管电泳的免疫分析平台具有相对简便快速的优点，但为了获得准确且可重复的实验结果，优化诸如蛋白浓度、抗体稀释度和孵育时间等实验条件仍然至关重要。通常，应执行以下步骤以针对此类系统优化实验方案：
1) 应进行筛选以评估并选择针对目标蛋白具有信号强度和特异性的抗体。如果有条件，可使用纯化的蛋白或目标表位来评估特异性；然而，仍需在来源于模型系统的总蛋白中评估潜在的非特异性信号。
2) 接下来需要确定该检测方法的动态范围。在理想情况下，当样品浓度加倍时，信号强度（通过峰面积测定）也应相应加倍；然而在实际操作中，信号随输入量的变化需以可预测的方式呈比例变化例如，线性拟合）足以用于蛋白质定量。此外，该优化可确定在信号较强但仍处于实验模型线性范围内的蛋白质浓度。
3）使用在优化步骤2中选定的固定蛋白质浓度，确定最佳抗体浓度。随着抗体浓度的增加，信号随之增强，直至达到饱和平台期。为准确测定蛋白质浓度，需采用接近此饱和水平的抗体浓度。
本研究以BEAS-2B细胞（一种SV-40转化的人支气管上皮细胞系）的全细胞提取物为例，演示了如何优化基于毛细管的自动化大小检测实验中的蛋白浓度、抗体稀释比例以及曝光时间6。细胞或组织提取物中的蛋白质分离可采用多种已发表的实验方案7,8,9完成，此处不再赘述。此外，还报告了在收获前于培养基中分别加入1.2、1.8和2.4 µg/mL的多柔比星（一种可诱导细胞凋亡的常用化疗药物10）处理4小时后，检测总p53蛋白及其在丝氨酸15和丝氨酸20位点磷酸化形式的试运行实验结果。p53的峰面积经ɑ-tubulin归一化处理，后者作为上样对照。
方案
注意：所有试剂和样品均需根据下述厂商提供的操作步骤进行准备。实验过程中请穿戴适当的个人防护装备，包括腈类手套、实验服、包趾鞋和护目镜。所需特定材料、试剂和设备的列表另见表格。应事先采用与裂解缓冲液兼容的成熟方法（如 Bradford 法）测定样品的总蛋白浓度11。
1. 按照生产商提供的标准试剂盒准备样品和试剂
- 配制 400 mM 的二硫苏糖醇（DTT）工作液时，向厂家提供的试剂管中加入 40 µL 去离子水。混匀时应缓慢轻柔地移液，避免产生气泡。
- 向粉红色管中加入 20 µL 10X 样品缓冲液和 20 µL 已配制的 400 mM DTT 溶液，该管内含有荧光 5X 主混合液（参见材料表）。
注意：主混合液（MM）由厂家用铝箔封口，需用移液器吸头刺破。混匀时应轻柔缓慢移液，避免 DTT 溅入移液器内。 - 随后，向厂家提供的白色生物素化 ladder 管中加入 16 µL 去离子水、2 µL 提供的 10X 样品缓冲液以及 2 µL 已配制的 400 mM DTT 溶液。轻柔混匀后转移至 0.6 mL 离心管中进行变性处理。
- 通过将提供的 10X 缓冲液按 1:100 比例用水稀释，配制 0.1x 样品缓冲液。根据待稀释样品总量，准备足量的 0.1x 样品缓冲液。
- 计算需加入样品中的 0.1x 样品缓冲液量，该体积取决于目标总蛋白终浓度。将 1 份 5x 荧光 MM 与 4 份稀释后的样品混合，以达到目标终蛋白浓度。
- 按以下方式计算各组分体积：（i）5x 荧光 MM 体积 =（目标终蛋白浓度）/5；（ii）蛋白原液体积 =（目标终蛋白浓度 × 所需总体积）/ 蛋白原液浓度；（iii）0.1x 样品缓冲液体积 = 总体积 - 5x MM 体积 - 蛋白原液体积。
2. 样品与分子量标准的变性处理
- 将制备好的样品和生物素标记的ladder放入一个 95 °C 5分钟后立即涡旋振荡各管，随后在台式离心机中离心约5秒，然后置于冰上。
注意：某些蛋白质可能需要更温和的变性条件（例如, 70 oC，10 分钟）以防止蛋白质聚集并改善毛细管基质中的迁移。如果高分子量区域出现严重拖尾现象时，请考虑此选项（参见视频示例）。
3. 抗体的制备
- 如通过优化确定（见 代表性结果 和 视频），配制所需稀释度的一抗（例如，1:50，1:100）加入提供的抗体稀释液2中。
注意：抗体在毛细管免疫电泳中的使用浓度通常高于传统蛋白质印迹实验。提供的二抗为即用型，无需稀释。
4. 鲁米诺-S 与过氧化物的制备
- 制备一份1:1的鲁米诺-S与过氧化物混合液。
- 涡旋混匀后置于冰上保存。
注意：该混合液需在每次实验检测前新鲜配制。运行一整块板所需混合液体积为250 µL。
5. 检测板的制备
- 如图所示 图1将上述制备的样品和试剂加入检测板中。每行的具体操作说明见下文。为尽量减少孔内液体蒸发，每次添加试剂后应及时盖好板盖。
- 在 A 行，用移液器吸取 5 µL 将生物素标记的Ladder加入A1孔。对于其余行，移液已制备的样品（5 µL 每个样品分别加入 A2-A25 孔中。
注意：A1 孔必须始终加入标准品，因为芯片中的第一个毛细管经过优化，专门用于该标准品的运行。 - 在B行，用移液器吸取 10 µL 向每个孔（B1-B25）中加入抗体稀释液2
- 在 C 行，用移液器吸取 10 µL 将2抗体稀释液加入C1孔中。在其余的C行孔中，用移液器加入 10 µL 一抗（孔 C2-C25）。
- 在 D 行，用移液器吸取 10 µL 将链霉亲和素-HRP加入D1孔中。在其余的D行孔中，用移液器移取 10 µL 二抗（D2-D25孔）
- 在 E 行，用移液器吸取 10 µL 将新配制的鲁米诺-过氧化物混合液加入每个孔（E1-E25）中。
- 最后，加入 500 µL 向缓冲液孔板的上三排每个孔中加入洗涤缓冲液。
注意：移液时应轻柔操作，切勿将枪头内最后的液体完全吹出，以尽量减少气泡的产生，因为气泡可能干扰毛细管上样和电泳运行。 - 所有孔加样完毕后，将板在约1000 × g、室温下离心5分钟，以去除气泡并确保液体沉至孔底。使用小吸头或洁净的针头刺破任何可见的气泡。例如，25号无菌“rep top”针头。
图1。检测板加样模板。 颜色编码表示加入检测板中的正确试剂和样品（最多共24个）。将生物素标记的蛋白分子量标准品加入A1孔（橙色），制备好的样品加入A2至A25孔（浅蓝色），抗体稀释液2加入B1至B25孔及C1孔（浅绿色），一抗加入C2至C25孔（蓝色），链霉亲和素-HRP加入D1孔（深粉色），二抗加入D2至D25孔（深绿色），鲁米诺-过氧化物混合液加入E1至E25孔（紫色）。洗涤缓冲液加入板中央较大孔的前三行（深蓝色）。请点击此处查看该图的放大版本。
6. 启动毛细管免疫分析仪
- 确保仪器及配套计算机已开启。无需预热时间。
- 打开计算机上的仪器软件。首先，在窗口右侧选择“Assay”选项卡，然后在左侧的“File Menu”下选择“New Assay”。选择大小、大小范围（例如，12-230 kDa）以及柱式类型（例如，25 毛细管）用于特定检测。
注意：可根据需要输入检测参数，包括蛋白质浓度、抗体类型及稀释度，但这些参数并非启动检测所必需。 - 按下橙色面板顶部的按钮，打开仪器门。
- 小心地从包装中取出毛细管盒。在不触碰玻璃毛细管本身的前提下，将毛细管盒放入卡盒支架中。通过观察内部指示灯由橙色变为蓝色，确认毛细管盒已正确安装。
- 将板牢固地固定在实验台上，小心地从板的下部剥离蒸发密封膜。使用微量移液器吸头或洁净的针头刺破分离胶孔中出现的任何气泡例如，25号无菌“rep top”针头。
- 将检测板放置在板架上，确保其完全就位，然后关闭仪器门。
- 单击软件中的“Start”按钮。
注意：若未出现“开始”按钮，则表示与仪器的连接已中断。请从左上角菜单中选择“仪器”，然后点击“连接”。此时应弹出显示仪器序列号的窗口，选择该序列号后点击“连接”，“开始”按钮即应出现。 - 运行结束后，弃去反应板。取出 cartridge 并放入锐器盒中，连同可能用于排除气泡的针头一并处理。若仪器需频繁使用，请保持电源开启，以避免连接问题。例如，至少每周一次。
7. 实验分析
- 分析前，请确保完成以下质量检查。
- 通过选择“显示标准品”图标来验证荧光标准品。在“图示视图”选项卡中检查标准品是否被正确识别。如果识别不正确，请切换至“单峰视图”图标，右键单击正确的峰并选择“设为标准品”，或右键单击错误的峰并选择“非标准品”。每次使用新的毛细管时均需执行此检查。
- 通过点击“样品”和“单峰视图”图标来验证生物素标记的分子量标记物。在实验选项卡中选择标记物。如果某个峰被错误识别，可在“图示视图”中右键单击该峰并选择“移除峰”。
注意：例如，12 - 230 kDa 试剂盒所用的生物素标记标记物应显示 12、40、66、116、180 和 230 kDa 的大小片段峰。若未执行此步骤，样品峰的大小计算将出现错误，导致产生虚假结果。 - 查看并分析样品峰。根据实验计算需要，从峰表中提取数据，包括分子量、峰面积、峰高以及信噪比（S/N）。
结果
曝光时间 - 确定信号饱和
当鲁米诺和过氧化物底物消耗过快时，可能会出现信号衰减现象。可通过检查不同化学发光曝光时间下的数据来判断此现象。在分析软件中，进入“编辑 -> 分析 -> 图像”选项，曝光时间范围为 5 至 480 秒。电泳图中的 y 轴表示信号/时间，因此各曝光条件下的数据应具有相似的信号/时间系数。如果鲁米诺被耗尽，随着曝光时间依次延长，该系数会下降，p53 DO-1 抗体的检测结果即显示了这一趋势（图 2）。由于底物耗尽，本实验仅在 5 至 30 秒的曝光时间内，对最高至 0.2 µg/µL 浓度的样品产生可测量信号。因此，在本示例中，确定 15 秒为 p53 数据分析的最佳曝光时间。
裂解液滴定 - 确定线性动态范围
测量必须在每种检测方法的线性动态范围内进行，以确保所测得的信号（以峰面积表示）变化与样品中蛋白含量的变化成正比。采用前一节选定的15 s最佳曝光时间，p53和ɑ-tubulin在超过15倍浓度范围内均表现出良好的检测线性图3）。根据我们的经验，一个 R2 值 >已知数量的纯化蛋白在稀释范围内的线性回归拟合值为0.9，若检测为绝对定量测量，则视为可接受；或对于靶蛋白含量未知的样本裂解液，若检测为相对定量测量，该值亦视为可接受。
抗体稀释度的优化
使用抗体的饱和浓度有助于确保所检测到的信号变化仅由蛋白量的变化引起。作为示例，使用两种BEAS-2B细胞系全细胞提取物（每项检测上样总蛋白浓度为0.2 µg/µL）进行实验，以连续稀释的ɑ-微管蛋白抗体（稀释度从1:25至1:800）进行探查（图4）。将化学发光信号（此处以峰面积表示）对抗体稀释倍数作图，在稀释度为1:50附近观察到信号达到饱和，此时曲线开始出现明显的平台期。
实验方案 - BEAS-2B细胞中的阿霉素处理
在优化的实验条件下，BEAS-2B 细胞培养物经三种不同浓度的阿霉素（1.2、1.8 和 2.4 µg/mL）处理 4 小时（图 5，表 1）。p53 通过翻译后修饰被激活，介导多种细胞反应，包括细胞周期阻滞、衰老和凋亡12。特别是，丝氨酸 15 位点的磷酸化被认为可促进 p53 的转录激活，从而在阿霉素处理后引发细胞凋亡13。在本实验中，以 α-微管蛋白归一化的峰面积表示相对于对照组的倍数变化。有趣的是，在阿霉素处理 4 小时后，p53 在丝氨酸 15 位点的磷酸化水平升高了 3.5 至 4 倍，而在丝氨酸 20 位点磷酸化的 p53 水平升高了约 2 倍。这些结果表明 p53 被激活；然而，在所选浓度下未观察到剂量-反应关系（相反，最低测试剂量引起的反应最强）。在该模型系统中，总 p53 水平未表现出明确的处理响应。我们此前在锌处理的 BEAS-2B 细胞中类似条件下，也观察到 p53 磷酸化激活而总 p53 水平未升高14。
图2。 曝光图像比较以检测信号烧蚀。泳道显示 BEAS-2B 裂解液在使用 p53 DO-1 抗体以 1:500 稀释度孵育后，蛋白质浓度递减的情况。化学发光信号系数以仪器软件中的峰高形式标出。与峰高不同，肉眼可见的条带强度由仪器自动生成并调整，以方便观察条带，因此不同图面板之间的条带强度不可相互比较。注意随着曝光时间增加，化学发光信号逐渐减弱，在最长的两次曝光中信号开始消失（峰分裂），表明底物已耗尽。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 裂解液滴定显示泳道视图裂解液滴定显示的条带图像 （A） 在使用1:500稀释的p53 DO-1或1:50稀释的ɑ-tubulin探针对BEAS-2B裂解液进行检测时。与峰面积值不同，仪器会自动生成并调整可视条带强度，以辅助条带观察，因此不同图组之间的条带强度不可相互比较。线性回归分析（B）证实了检测在整个测试范围内（从0.01到）呈线性 0.20 µg/µL 和 0.025 至 0.40 µg/µL，其中R2 分别为 0.999 和 0.985。选择线性范围中段的总蛋白浓度，以适应目标蛋白在任一方向上的潜在变化。例如, 0.2 µg/µL （针对α-tubulin）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4。 两种独立的 BEAS-2B 蛋白裂解液在有无基线归一化情况下的 α-微管蛋白抗体稀释曲线。在 1:50（0.02）稀释度时明显偏离线性，表明已达到饱和。因此选择 1:50 作为该抗体的最佳稀释度。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5.4小时多柔比星（DXN）处理对BEAS-2B细胞总p53蛋白及丝氨酸磷酸化p53蛋白表达的影响。 峰面积经α-微管蛋白归一化后，以对照组（CTL）的倍数表示。请点击此处查看该图的放大版本。
表1. 4小时阿霉素（DXN）处理对BEAS-2B细胞总p53蛋白及丝氨酸磷酸化p53蛋白表达水平的影响。 请点击此处查看此表格的放大版本。
讨论
几十年来，基于毛细管电泳的免疫分析方法一直备受关注，因其样品和试剂消耗量低，与传统方法相比处理时间更短，且易于实现自动化操作4,15。已有多种利用毛细管进行蛋白质分离的不同方案，包括电泳法、电动法、聚合物筛分法和等电聚焦法，这些方法分别依据蛋白质的静电荷、分配平衡、分离基质的筛分特性以及pH等不同性质进行分离16。本文介绍一种基于抗体（即免疫分析）的毛细管电泳方法，采用聚合物筛分分离模式，已实现自动化并被商业化应用3。该系统的优点包括操作简便、试剂标准化且可商业化获取，以及检测结果可靠、灵敏度高，所需试剂和样品量少于传统的蛋白质检测方法，如Western印迹、酶联免疫吸附测定及其他检测形式3,4,5。以往对该技术的评估指出，可检测蛋白质的分子量范围受限于可用的分离基质4，但近期的产品已将可测范围扩展至2–440 kDa17。此外，已知某些裂解缓冲液与该检测不兼容18，因此在实验前必须慎重选择所用试剂。
使用市售组分的自动化操作方法的一个主要优势在于，通过标准化的方法和试剂，能够获得一致的实验结果。该方法通过自动化操作流程中的关键步骤，最大限度地降低了检测失败的可能性。然而，需要注意的是，在实验过程中必须遵循某些操作规范，以尽量减少基于毛细管电泳的免疫检测可能出现的问题。首先，鲁米诺-S/过氧化物混合液必须在上板前新鲜配制并立即使用。在加入氧化剂后，若配制时间保持一致，则发光信号将保持稳定，从而确保特定抗体检测在多次实验间获得一致的测量结果。此外，必须使用未过期的试剂，因为试剂的有效性主要影响氧化剂的活性。同时，必须严格遵守样品、抗体及其他试剂的加样顺序（见图1）。任何试剂若被错误移取或加样顺序出错，都将导致检测失败和实验运行的浪费。
除了这些关键步骤外，该技术通常遇到的主要问题一般都可以通过优化来解决。事实上，这些条件对于每种模型系统/抗体组合都是特定的，因此需要针对每个新检测方法通过实验经验来确定。本文重点介绍三种常见的优化程序：曝光时间、裂解液滴定以及一抗稀释度。获得可测量结果的能力取决于对曝光时间的分析，即在鲁米诺底物未被迅速耗尽的情况下进行检测，因为底物的快速消耗会导致信号丢失。裂解液滴定用于确定每个检测方法的线性动态范围，该范围可能因不同的模型系统以及不同抗体而异，即使针对相同的蛋白质靶标也是如此。选择在或接近饱和浓度下的一抗稀释度，可确保信号变化不受游离抗体不足的影响，而仅反映可用蛋白质靶标表位数量的差异。优化过程中其他需要考虑的因素可能包括抗体孵育时间以及上样/样品加载时间。在大多数情况下，仪器的默认设置能够在分辨率和灵敏度之间提供最佳平衡。然而，在某些情况下，通过调整这些参数可以改善较差的分辨率或灵敏度。
基于毛细管电泳的免疫分析方法可实现快速、高效且可重复的蛋白质检测。尽管这些方法主要应用于研发领域，但其技术一致性在法规监管和临床应用中具有潜在价值。例如，通过血液、尿液和唾液等易获取基质中测得的蛋白质生物标志物，可识别对环境毒物易感的人群或判断疾病进展的患者。随着试剂和操作成本的降低，以及可同时检测的样本数量和靶标数量的增加，基于毛细管电泳的免疫分析方法有望被广泛应用于此类领域。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。本稿件已通过国家健康与环境效应研究实验室的审查，并获准发表。本内容不一定反映美国环境保护局（US EPA）的观点，且提及贸易名称或商业产品并不构成对其使用之认可或推荐。
致谢
作者感谢美国环境保护局研究与发展办公室-研究三角园（ORD-RTP）图形与媒体团队的 Keith Tarpley 在教学视频的制作、拍摄和编辑过程中提供的帮助。我们还要感谢 ProteinSimple 公司的 Deborah Pritchett 就数据优化问题进行的有益讨论。 J.M. Guynn 得到了美国环境保护局橡树岭科学与教育研究所研究/参与项目的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Wes 仪器 | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
| p53 DO-1 一抗 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
| 磷酸化 p53（ser 15）一抗 | Cell Signaling Technology | 9286 | |
| 磷酸化 p53（ser 20）一抗 | Cell Signaling Technology | 9287 | |
| α-微管蛋白一抗 | Cell Signaling Technology | 3873 | 用作上样对照 |
| Compass 软件 | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 随 Wes 仪器提供 | |
| 12-230 kDa 主试剂盒 | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02（现已被新试剂盒编号取代） | |
| www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | 包含货号： 洗涤缓冲液（60 mL）042-202 10X 样品缓冲液（440 μL）042-195 预填充微孔板（8 个）PS-PP01 毛细管盒（8 个）PS-CC01 抗体稀释液 II（20 mL）042-203 鲁米诺-S（1.5 mL）042-233 过氧化物（1.5 mL）042-234 链霉亲和素-HRP（132 μL）042-414 标准品套装（8 份）：生物素化蛋白分子量标记、5X 荧光主混合液、DTT 和空的 0.6 mL 管 PS-ST01 抗兔二抗 042-206 或 抗鼠二抗 042-205 | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 细胞培养、处理与收获（使用供应商推荐的方案；方案未包含在文稿中） | |||
| BEAS-2B 细胞 | 美国典型培养物保藏中心（ATCC, Manassas, VA） | CRL-9609 | |
| 角质形成细胞生长培养基 KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | 用于细胞培养 |
| 角质形成细胞基础培养基 KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | 用于化学处理的无血清培养基 |
| 阿霉素 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
| 考马斯亮蓝 Bradford 检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | 用于蛋白质定量 |
| 核提取试剂盒 | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | 用于制备全细胞裂解液 |
| 包含： | |||
| 裂解缓冲液 AM1 | |||
| 1 M 二硫苏糖醇（DTT） | |||
| 蛋白酶抑制剂混合液 | |||
| 10X PBS | |||
| 磷酸酶抑制剂 |
参考文献
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重印与许可
