基于自动化毛细管电泳免疫分析方法的实验步骤与关键优化策略

摘要

介绍了一种基于毛细管的免疫分析方法，利用商业平台从总蛋白样品中检测目标蛋白。此外，针对细胞培养模型系统，优化了曝光时间、蛋白浓度和抗体稀释度等分析参数。

摘要

与传统的免疫测定方法相比，基于毛细管的免疫测定新技术有望实现更快且更定量的蛋白质检测。然而，与其他基于抗体的蛋白质检测方法类似，优化基于毛细管的免疫测定参数（如蛋白质浓度、抗体稀释度和曝光时间）是获得有意义且可靠数据的重要前提。检测信号必须落在测定方法的线性范围内，以确保信号变化与裂解液浓度变化呈直接正比关系。本文以人支气管上皮细胞系 BEAS-2B 为例，演示了如何选择合适的裂解液浓度、抗体稀释度和曝光时间。使用抗 p53 和抗 α-微管蛋白（α-tubulin）抗体，在一系列全细胞提取物蛋白质浓度下展示了检测的线性范围。结果显示，在高浓度条件下延长曝光时间会导致信号饱和（信号烧灼），并展示了 α-微管蛋白抗体的稀释曲线以说明抗体饱和现象。此外，还报告了采用优化参数检测阿霉素处理细胞的示例实验结果。

引言

毛细管电泳免疫分析利用基于分子大小或电荷的分离系统，检测细胞裂解液中的蛋白质表达水平，相较于传统免疫分析方法具有多项优势。例如，与蛋白质印迹法（western blot）相比，基于毛细管的自动化流程无需使用凝胶、转膜装置以及人工洗涤步骤。此外，所需蛋白样品量大约减少至原来的十分之一，使得毛细管系统特别适用于稀有细胞类型或样本量有限的情况^1,2。使用自动化系统可在短短3小时内获得结果，且已有研究证明其定量性和重复性优于传统的蛋白质印迹法^3,4,5。基于分子大小的分析流程包括：将含有十二烷基硫酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）以及荧光标记的分子量标准品的样品加入毛细管柱中，毛细管内含有浓缩胶和分离胶基质。施加电压后，样品中的蛋白质根据分子大小在毛细管中实现分离，随后通过紫外光将分离后的蛋白质固定于毛细管内壁。接着使用靶标特异性的初级抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的次级抗体对毛细管进行免疫探针反应。鲁米诺和过氧化物催化产生化学发光，发出的光信号由电荷耦合器件（CCD）相机检测，并用于蛋白质的定量分析。

尽管基于毛细管电泳的免疫分析平台具有相对简便快速的优点，但为了获得准确且可重复的实验结果，优化诸如蛋白浓度、抗体稀释度和孵育时间等实验条件仍然至关重要。通常，应执行以下步骤以针对此类系统优化实验方案：

1) 应进行筛选以评估并选择针对目标蛋白具有信号强度和特异性的抗体。如果有条件，可使用纯化的蛋白或目标表位来评估特异性；然而，仍需在来源于模型系统的总蛋白中评估潜在的非特异性信号。

2) 接下来需要确定该检测方法的动态范围。在理想情况下，当样品浓度加倍时，信号强度（通过峰面积测定）也应相应加倍；然而在实际操作中，信号随输入量的变化需以可预测的方式呈比例变化例如，线性拟合）足以用于蛋白质定量。此外，该优化可确定在信号较强但仍处于实验模型线性范围内的蛋白质浓度。

3）使用在优化步骤2中选定的固定蛋白质浓度，确定最佳抗体浓度。随着抗体浓度的增加，信号随之增强，直至达到饱和平台期。为准确测定蛋白质浓度，需采用接近此饱和水平的抗体浓度。

本研究以BEAS-2B细胞（一种SV-40转化的人支气管上皮细胞系）的全细胞提取物为例，演示了如何优化基于毛细管的自动化大小检测实验中的蛋白浓度、抗体稀释比例以及曝光时间⁶。细胞或组织提取物中的蛋白质分离可采用多种已发表的实验方案^7,8,9完成，此处不再赘述。此外，还报告了在收获前于培养基中分别加入1.2、1.8和2.4 µg/mL的多柔比星（一种可诱导细胞凋亡的常用化疗药物¹⁰）处理4小时后，检测总p53蛋白及其在丝氨酸15和丝氨酸20位点磷酸化形式的试运行实验结果。p53的峰面积经ɑ-tubulin归一化处理，后者作为上样对照。

方案

注意：确保所有试剂和样品均按照下述制造商方案进行准备。操作过程中请穿戴适当的个人防护装备，包括腈类手套、实验服、包趾鞋和护目镜。所需特定材料、试剂和设备的清单另附。应事先采用与裂解缓冲液兼容的成熟方法（如 Bradford 法）测定样品的总蛋白浓度¹¹。

1. 按照生产商提供的标准试剂盒准备样品和试剂

1. 配制400 mM的二硫苏糖醇（DTT）工作液：向厂家提供的原装透明管中加入40 µL去离子水。通过缓慢而轻柔的移液操作混匀溶液，注意避免产生气泡。
2. 向含有荧光5X主混合液的粉红色管中加入20 µL 10X样品缓冲液和20 µL已配制的400 mM DTT溶液（参见材料表）。
   注意：主混合液（MM）由厂家用铝箔密封，需用移液器吸头刺穿。通过缓慢移液轻轻混匀，避免DTT溅入移液器内。
3. 接下来，向厂家提供的白色生物素化梯度标记管中加入16 µL去离子水、2 µL提供的10X样品缓冲液和2 µL已配制的400 mM DTT溶液。轻轻混匀后转移至0.6 mL离心管中用于变性处理。
4. 通过将提供的10X缓冲液按1:100比例用水稀释，配制0.1x样品缓冲液。根据所有样品的稀释需求，准备足量的0.1x样品缓冲液。
5. 计算需加入样品中的0.1x样品缓冲液量，该体积取决于目标总蛋白的最终浓度。将1份5x荧光MM与4份稀释后的样品混合，以达到所需的最终蛋白浓度。
   1. 按以下方式计算体积：(i) 5x荧光MM体积 =（目标最终蛋白浓度）/5；(ii) 蛋白原液体积 =（目标最终蛋白浓度 × 所需总体积）/ 蛋白原液浓度；(iii) 0.1x样品缓冲液体积 = 总体积 - 5x MM体积 - 蛋白原液体积。

2. 样品和DNA标记物的变性

1. 将制备好的样品和生物素标记的ladder置于95 °C金属浴中孵育5 min。孵育后立即涡旋振荡各管，在台式离心机中离心约5 s，然后置于冰上。
   注意：某些蛋白质可能需要更温和的变性条件（例如, 70 ^o10 分钟）以防止蛋白质聚集并改善其在毛细管基质中的迁移。如果高分子量区域出现严重拖尾现象时，可考虑采用此方法（参见视频示例）。

3. 抗体的制备

1. 根据优化结果（参见代表性结果和视频），在提供的抗体稀释液2中配制所需稀释倍数的一抗（例如，1:50，1:100）。
   注意：与传统的蛋白质印迹法相比，毛细管免疫分析中一抗通常使用较高浓度。提供的二抗无需稀释，可直接使用。

4. 鲁米诺-S 和过氧化物的制备

1. 配制 luminol-S 与过氧化物的 1:1 混合液。
2. 涡旋混匀后置于冰上保存。
   注意：每次实验检测均需新鲜配制该混合液。运行整块板所需混合液总量为 250 µl。

5. 检测板的制备

1. 如图所示 图1将上述制备的样品和试剂加入检测板中。每行的具体操作说明见下文。为尽量减少孔内液体蒸发，每次添加试剂后应及时盖上板盖。
2. 在A行，将5 µL生物素标记的Ladder通过移液器加入A1孔中。对于其余样品，将制备好的样本（每份5 µL）加入A2至A25孔中。
   注意：A1 孔必须始终加入标准品，因为芯片中的第一根毛细管经过优化，专门用于运行该标准品。
3. 在B行的每个孔（B1-B25）中加入10 µL抗体稀释液2。
4. 在C行，向C1孔中加入10 µL抗体稀释液2。在其余C行孔中（C2-C25孔），各加入10 µL一抗。
5. 在 D 行，将 10 µL 链霉亲和素-HRP 加入 D1 孔中。在其余 D 行孔（D2-D25 孔）中，各加入 10 µL 二抗。
6. 在E行，将10 µL新配制的鲁米诺-过氧化物混合液加入每个孔（E1-E25）中。
7. 最后，向缓冲液孔板的上三排每个孔中分别加入 500 µL 洗涤缓冲液。
   注意：移液时应轻柔操作，切勿将枪头内最后一滴液体完全吹出，以尽量减少气泡产生，因为气泡可能干扰毛细管加样及电泳运行。
8. 所有孔加样完毕后，在室温下以约1000 × g离心5分钟，以去除气泡并确保液体沉降至孔底。使用微量移液器吸头或洁净的针头刺破任何可见的气泡。例如，25号无菌“rep top”针头。

图 1。检测板加样模板。 颜色编码表示加入检测板中的正确试剂和样本（最多 24 个）。将生物素标记的分子量标准品加入 A1 孔（橙色），将制备好的样本从 A2 孔至 A25 孔（浅蓝色），抗体稀释液 2 加入 B1 至 B25 孔及 C1 孔（浅绿色），一抗加入 C2 至 C25 孔（蓝色），链霉亲和素-HRP 加入 D1 孔（深粉色），二抗加入 D2 至 D25 孔（深绿色），鲁米诺-过氧化物混合液加入 E1 至 E25 孔（紫色）。洗涤缓冲液加入板中央较大孔的前三行（深蓝色）。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 启动毛细管免疫分析仪

1. 确保仪器及配套计算机已开启。无需预热时间。
2. 在计算机上打开仪器软件。首先，选择窗口右侧的“Assay”选项卡，然后在左侧的“File Menu”中选择“New Assay”。选择用于该次检测的尺寸、尺寸范围（例如，12–230 kDa）和芯片类型（例如，25根毛细管）。
   注意：可根据需要输入检测参数，包括蛋白浓度、抗体类型和稀释倍数，但这些参数并非启动检测所必需。
3. 按下橙色面板顶部的按钮，打开仪器门。
4. 小心地从包装中取出毛细管芯片，避免触碰玻璃毛细管部分。将芯片放入芯片架中，并通过观察内部指示灯由橙色变为蓝色，确认芯片已正确安装。
5. 将检测板牢固地固定在实验台上，小心地从板的下部撕去防蒸发密封膜。使用小移液器吸头或洁净针头（例如，25号无菌“rep top”针头）戳破分离胶孔中出现的任何气泡。
6. 将检测板放置在板架上，确保其完全就位，然后关闭仪器门。
7. 点击软件中的“Start”按钮。
   注意：若未出现“Start”按钮，则表示与仪器的连接已丢失。请从左上角菜单选择“Instrument”，然后选择“Connect”。此时应弹出显示仪器序列号的窗口；选择该序列号后点击“Connect”。此时“Start”按钮应会显示。
8. 运行完成后，丢弃检测板。取出芯片并连同用于戳破气泡的任何针头一起放入锐器盒中进行处理。若仪器使用频繁（例如，每周至少一次），请保持电源开启，以避免连接问题。

7. 实验分析

1. 分析前，请确保完成以下质量检查。
   1. 通过点击“显示标准品”图标来验证荧光标准品。在“图谱视图”选项卡中检查标准品是否被正确识别。如果识别错误，请切换至“单峰视图”图标，右键单击正确的峰并选择“设为标准品”，或右键单击错误的峰并选择“非标准品”。每次使用新的毛细管时均需执行此检查。
   2. 通过点击“样品”和“单峰视图”图标来验证生物素标记的分子量标记物。在实验选项卡中选择该标记物。如果某个峰被错误识别，请在“图谱视图”中右键单击该峰并选择“删除峰”。
      注意：例如，12 - 230 kDa 试剂盒所用的生物素标记分子量标记物应显示 12、40、66、116、180 和 230 kDa 的大小峰。若未执行此步骤，样品峰的大小计算将出现错误，导致产生虚假结果。
   3. 查看并分析样品峰。根据实验计算需要，从峰表中获取数据，包括分子量、峰面积、峰高和信噪比（S/N）。

结果

曝光时间 - 确定信号饱和

当鲁米诺和过氧化物底物消耗过快时，可能会发生信号衰减。可通过检查不同化学发光曝光时间下的数据来判断此现象。在分析软件中，进入“编辑 -> 分析 -> 图像”选项。曝光时间范围为 5 至 480 秒。电泳图的 y 轴表示信号/时间，因此各曝光时间下的数据应具有相似的信号/时间系数。如果鲁米诺发生耗尽，该系数会随着曝光时间依次延长而下降，p53 DO-1 抗体的结果即显示了这一情况（图 2）。由于底物耗尽，该检测仅在 5 至 30 秒的曝光时间内，对最高至 0.2 µg/µL 浓度的样品可进行有效测量。因此，在本示例中，确定 15 秒为 p53 数据分析的最佳曝光时间。

裂解液滴定 - 确定线性动态范围

每种检测的测量必须在其线性动态范围内进行，此时由峰面积测得的信号变化与样品中蛋白含量的变化成正比。采用上一节选定的15秒最佳曝光时间，p53和ɑ-微管蛋白的检测在线性范围内表现出超过15倍的浓度变化范围（图3）。根据我们的经验，对于已知数量的纯化蛋白稀释范围（若检测为绝对定量测量）或目标蛋白含量未知的样品裂解液（若检测为相对定量测量），线性回归拟合的R²值达到>0.9即被视为可接受。

抗体稀释度的优化

使用饱和浓度的抗体有助于确保所检测到的信号变化仅由蛋白量的变化引起。作为示例，将两种BEAS-2B细胞系全细胞提取物（每项检测上样总蛋白浓度为0.2 µg/µL）与系列稀释的ɑ-微管蛋白抗体（稀释倍数从1:25至1:800）进行孵育（图4）。将化学发光信号（此处以峰面积表示）对抗体稀释倍数作图，结果显示在1:50稀释时接近饱和，此时曲线开始出现明显的平台期。

实验方案 - BEAS-2B 细胞中阿霉素处理

在优化的实验条件下，BEAS-2B 细胞培养物经三种不同浓度的阿霉素（1.2、1.8 和 2.4 µg/mL）处理 4 小时（图 5，Table 1）。p53 通过翻译后修饰被激活，介导多种细胞反应，包括细胞周期阻滞、衰老和凋亡¹²。特别是，丝氨酸 15 位点的磷酸化被认为可促进 p53 的转录激活，从而在阿霉素处理后引发细胞凋亡¹³。在本实验中，以 α-微管蛋白归一化的峰面积表示相对于对照组的倍数变化。有趣的是，在阿霉素处理 4 小时后，观察到 p53 在丝氨酸 15 位点的磷酸化水平升高了 3.5 至 4 倍，而在丝氨酸 20 位点的磷酸化水平升高了约 2 倍。这些结果表明 p53 被激活；然而，在所选浓度范围内未观察到剂量-效应关系（相反，测试的最低剂量引发了最强的反应）。在该模型系统中，总 p53 水平未表现出明确的处理响应。我们此前在锌处理的 BEAS-2B 细胞中，在类似条件下也观察到 p53 磷酸化被激活，而总 p53 水平并未升高¹⁴。

图2。 比较不同曝光时间图像以检测信号饱和。泳道显示使用p53 DO-1抗体（1:500稀释）检测的BEAS-2B裂解液中蛋白浓度递减的情况。化学发光信号系数以仪器软件报告的峰高形式叠加显示。与峰高不同，肉眼可见的条带强度由仪器自动生成并调整，以方便观察条带，因此不同图面板之间的条带强度不可比较。注意随着曝光时间延长，化学发光信号逐渐减弱，在两个最长曝光时间下信号开始消失（峰分裂），表明底物耗尽。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 裂解液滴定显示泳道视图裂解液滴定显示的泳道视图 （A） 使用1:500稀释的p53 DO-1抗体或1:50稀释的ɑ-tubulin抗体检测BEAS-2B裂解液时的结果。与峰面积数值不同，条带的视觉强度由仪器自动生成并调整，以增强条带的可视性，因此不同图谱之间的视觉强度不可相互比较。线性回归分析（B)证实了检测在0.01至0.20 µg/µL和0.025至0.40 µg/µL的整个测试范围内均呈线性，R² 分别为 0.999 和 0.985。选择线性范围中段的总蛋白浓度，以适应目标蛋白含量在两个方向上可能存在的变异（例如，α-tubulin 为 0.2 µg/µL。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 4。 两种独立的 BEAS-2B 蛋白裂解液中 α-微管蛋白抗体稀释曲线（含与不含基线归一化）。在 1:50（0.02）稀释度时明显偏离线性，表明已达到饱和。因此选择 1:50 作为该抗体的最佳稀释度。请点击此处查看该图的放大版本。

图5.4小时阿霉素（DXN）处理对BEAS-2B细胞总p53蛋白及丝氨酸磷酸化p53蛋白表达的影响。 峰面积已相对于α-微管蛋白归一化，并以对照组（CTL）的倍数表示。请点击此处查看该图的放大版本。

表1. 4小时阿霉素（DXN）处理对BEAS-2B细胞总p53蛋白及丝氨酸磷酸化p53蛋白表达水平的影响。 请点击此处查看本表的放大版本。

讨论

几十年来，基于毛细管电泳的免疫分析方法一直备受关注，因其样品和试剂消耗量低，与传统方法相比处理时间更短，且易于实现自动化操作^4,15。已有多种利用毛细管进行蛋白质分离的不同方案，包括电泳法、电动法、聚合物筛分法和等电聚焦法，这些方法分别依据蛋白质的静电荷、分配平衡、分离基质的筛分特性以及pH等不同性质进行分离¹⁶。本文介绍一种基于抗体（即免疫分析）的毛细管电泳方法，采用聚合物筛分分离模式，已实现自动化并被商业化应用³。该系统的优点包括操作简便、试剂标准化且可商业化获取，以及检测结果可靠、灵敏度高，所需试剂和样品量少于传统的蛋白质检测方法，如Western印迹、酶联免疫吸附测定及其他检测形式^3,4,5。以往对该技术的评估指出，可检测蛋白质的分子量范围受限于可用的分离基质⁴，但近期的产品已将可测范围扩展至2–440 kDa¹⁷。此外，已知某些裂解缓冲液与该检测不兼容¹⁸，因此在实验前必须慎重选择所用试剂。

使用市售组分的自动化操作方法的一个主要优势在于，通过标准化的方法和试剂，能够获得一致的实验结果。该方法通过自动化操作流程中的关键步骤，最大限度地降低了检测失败的可能性。然而，需要注意的是，在实验过程中必须遵循某些操作规范，以尽量减少基于毛细管电泳的免疫检测可能出现的问题。首先，鲁米诺-S/过氧化物混合液必须在上板前新鲜配制并立即使用。在加入氧化剂后，若配制时间保持一致，则发光信号将保持稳定，从而确保特定抗体检测在多次实验间获得一致的测量结果。此外，必须使用未过期的试剂，因为试剂的有效性主要影响氧化剂的活性。同时，必须严格遵守样品、抗体及其他试剂的加样顺序（见图1）。任何试剂若被错误移取或加样顺序出错，都将导致检测失败和实验运行的浪费。

除了这些关键步骤外，该技术通常遇到的主要问题一般都可以通过优化来解决。事实上，这些条件对于每种模型系统/抗体组合都是特定的，因此需要针对每个新检测方法通过实验经验来确定。本文重点介绍三种常见的优化程序：曝光时间、裂解液滴定以及一抗稀释度。获得可测量结果的能力取决于对曝光时间的分析，即在鲁米诺底物未被迅速耗尽的情况下进行检测，因为底物的快速消耗会导致信号丢失。裂解液滴定用于确定每个检测方法的线性动态范围，该范围可能因不同的模型系统以及不同抗体而异，即使针对相同的蛋白质靶标也是如此。选择在或接近饱和浓度下的一抗稀释度，可确保信号变化不受游离抗体不足的影响，而仅反映可用蛋白质靶标表位数量的差异。优化过程中其他需要考虑的因素可能包括抗体孵育时间以及上样/样品加载时间。在大多数情况下，仪器的默认设置能够在分辨率和灵敏度之间提供最佳平衡。然而，在某些情况下，通过调整这些参数可以改善较差的分辨率或灵敏度。

基于毛细管电泳的免疫分析方法可实现快速、高效且可重复的蛋白质检测。尽管这些方法主要应用于研发领域，但其技术一致性在法规监管和临床应用中具有潜在价值。例如，通过血液、尿液和唾液等易获取基质中测得的蛋白质生物标志物，可识别对环境毒物易感的人群或判断疾病进展的患者。随着试剂和操作成本的降低，以及可同时检测的样本数量和靶标数量的增加，基于毛细管电泳的免疫分析方法有望被广泛应用于此类领域。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Wes 仪器	ProteinSimple (Santa Clara, CA)	004-600
p53 DO-1 一抗	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-126
磷酸化 p53（ser 15）一抗	Cell Signaling Technology	9286
磷酸化 p53（ser 20）一抗	Cell Signaling Technology	9287
α-微管蛋白一抗	Cell Signaling Technology	3873	用作上样对照
Compass 软件	ProteinSimple (Santa Clara, CA)		随 Wes 仪器提供
12-230 kDa 主试剂盒	ProteinSimple (Santa Clara, CA)	PS MK02（现已被新试剂盒编号取代）
	www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html	包含货号： 洗涤缓冲液（60 mL）042-202 10X 样品缓冲液（440 μL）042-195 预填充微孔板（8 个）PS-PP01 毛细管盒（8 个）PS-CC01 抗体稀释液 II（20 mL）042-203 鲁米诺-S（1.5 mL）042-233 过氧化物（1.5 mL）042-234 链霉亲和素-HRP（132 μL）042-414 标准品套装（8 份）：生物素化蛋白分子量标记、5X 荧光主混合液、DTT 和空的 0.6 mL 管 PS-ST01 抗兔二抗 042-206 或 抗鼠二抗 042-205
名称	公司	目录编号	备注
细胞培养、处理与收获（使用供应商推荐的方案；方案未包含在文稿中）
BEAS-2B 细胞	美国典型培养物保藏中心（ATCC, Manassas, VA）	CRL-9609
角质形成细胞生长培养基 KGM Gold	Lonza Ltd (Basel, Switzerland)	192152	用于细胞培养
角质形成细胞基础培养基 KBM Gold	Lonza Ltd (Basel, Switzerland)	192151	用于化学处理的无血清培养基
阿霉素	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	D1515
考马斯亮蓝 Bradford 检测试剂盒	ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)	23200	用于蛋白质定量
核提取试剂盒	Active Motif (Carlsbad, CA)	D1515	用于制备全细胞裂解液
		包含：
		裂解缓冲液 AM1
		1 M 二硫苏糖醇（DTT）
		蛋白酶抑制剂混合液
		10X PBS
		磷酸酶抑制剂