Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.
De meerderheid van de momenteel beschikbare insecticiden richten op het zenuwstelsel en genetische mutaties van ongewervelde neurale eiwitten opleveren vaak schadelijke gevolgen, maar de huidige methoden voor het opnemen van zenuwstelsel activiteit van een individu dier is duur en arbeidsintensief. Deze zuigkracht elektrode voorbereiding van de derde-instar larvale centraal zenuwstelsel van Drosophila melanogaster, is een hanteerbare systeem voor het testen van de fysiologische effecten van neuroactive agentia, bepaling van de fysiologische rol van diverse neurale emissieroutes naar CNS activiteit, evenals de invloed van genetische mutaties neurale functie. Deze voorbereiding ex vivo vereist enige matige ontrafeling van vaardigheid en elektrofysiologische expertise tot reproduceerbare opnames van insecten Neuronale activiteit te genereren. Een breed scala aan chemische modulatoren, met inbegrip van peptides, kan vervolgens rechtstreeks aan het zenuwstelsel in oplossing met de fysiologische zoutoplossing voor het meten van de invloed op de activiteit van de CNS worden toegepast. Verdere, genetische technologieën, zoals de GAL4/UAS-systeem, kunnen zelfstandig of samen met farmacologische agenten om te bepalen van de rol van specifieke ionenkanalen, vervoerders of receptoren aan geleedpotigen CNS functie worden toegepast. In dit verband zijn de hierin beschreven tests van significant belang insecticide toxicologen, insect fysiologen en ontwikkelingsstoornissen biologen waarvoor D. melanogaster een gevestigde model-organisme is. Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een elektrofysiologische methode zodat de meting van de electrogenesis van het centrale zenuwstelsel in het model insect, Drosophila melanogaster, dat is handig voor het testen van een verscheidenheid aan wetenschappelijke hypothesen.
Het algemene doel van deze aanpak is om onderzoekers te snel meten de electrogenesis van het centrale zenuwstelsel (CNS) in het model insect, Drosophila melanogaster. Deze methode is betrouwbaar, snel en kostenefficiënt om uit te voeren van de fysiologische en toxicologische experimenten. De CNS is essentieel voor het leven en daarom de fysiologische trajecten kritische voor neurale werking hebben uitgebreid onderzocht in een poging om te begrijpen of wijzigen van neurale functie. Karakterisering van de signaalroutes binnen de geleedpotigen CNS heeft de ontdekking van verschillende chemische klassen van insecticiden die ongewervelde neurale functie verstoren om sterfte veroorzaken terwijl het beperken van de gevolgen van de af-target ingeschakeld. Dus, de mogelijkheid voor het meten van de neurale activiteit van insecten is van aanzienlijk belang op het gebied van insecten toxicologie en fysiologie aangezien het zenuwstelsel het doelweefsel is terechtgekomen van de meerderheid van de geïmplementeerde insecticiden1 is. Toch bleef groei van fundamentele en toegepaste kennis over het insect zenuwstelsel vereist geavanceerde neurofysiologische technieken die zijn beperkt in de haalbaarheid, aangezien de huidige technieken zijn arbeidsintensief en vereist een hoge kosten, insect neurale cellijnen zijn beperkt, en/of er is beperkte toegang tot de centrale synapsen meeste geleedpotigen. Momenteel, vereist karakterisering van de meeste insecten neurale eiwitten het doelwit te zijn van gekloonde en geïnfecteerd uitgedrukt voor latere drugontdekking en elektrofysiologische opnamen, zoals werd beschreven voor insect innerlijke gelijkrichter kalium kanalen2 , insect ryanodine receptor3, mug spanning-gevoelige K+ kanalen4, en anderen. Ter beperking van de eis van heterologe expressie en het potentieel voor lage functionele expressie, Bloomquist en collega’s gericht voor het opwekken van een neuronale fenotype in gekweekte cellen Spodoptera frugiperda (Sf21) als een nieuwe methode voor insecticide ontdekking5,6. Deze methoden geven een geldige benadering voor de ontwikkeling van nieuwe scheikunde, maar zij maken vaak een onoverkomelijke knelpunt voor de karakterisatie van farmacologische agenten, identificeren van mechanismen van insecticide resistentie en karakterisering van fysiologische grondbeginselen. Hier beschrijven we een ex vivo -methode, waarmee de registratie van de elektrische activiteit van een model-insect dat smeedbaar genetica7,8,9 heeft en bekende expressiepatronen van neurale complexen10,11,12 om de karakterisatie van resistentie mechanismen op het niveau van de zenuw, het werkingsmechanisme van nieuw ontwikkelde geneesmiddelen en andere toxicologische studies.
De fruitvlieg, D. melanogaster, is een gemeenschappelijk modelorganisme voor het definiëren van insecten neurale systemen of insecticide werkingsmechanisme en is opgericht als een geschikt model-organisme voor de studie van toxicologische13, farmacologische14 ,15, neurofysiologische16en pathofysiologische17,18,19,20 processen van gewervelde dieren. D.melanogaster is een holometabolous insect waarmee complete metamorfose, met inbegrip van een larvale en pop fase vóór het bereiken van de reproductieve volwassen stadium. Gedurende de ontwikkelings proces, zal het zenuwstelsel ondergaat aanzienlijke remodelleren in verschillende levensfasen, maar de larvale CNS de focus van deze methodologie. De volledig ontwikkelde larval CNS is anatomisch eenvoudig met borst- en buikholte segmenten die worden gesmolten en vormen de ventrale ganglion, die een matrix met herhaalde en bijna identieke neuromeric eenheden21,22 vertegenwoordigt. Aflopende motorzenuwen zijn afkomstig uit het caudal einde van de ganglia van de subesophageal en dalen om de innervate lichaam muur spieren en viscerale organen van de larven. Figuur 1 beschrijft de bruto-anatomie van de larvale Drosophila CNS.
De Drosophila bloed – hersenbarrière (BBB) ontwikkelt aan het einde van de embryogenese en wordt gevormd door subperineurial gliale cellen (SPG)21. De SPG-cellen vormen talrijke filopodia-achtige processen die verspreid om een aaneengesloten, zeer plat, endotheel-achtige vel dat betrekking heeft op de gehele Drosophila CNS-23. De Drosophila BBB heeft overeenkomsten met de gewervelde BBB, waarin het behoud van de homeostase van de neurale communicatie door middel van de vermelding van voedingsstoffen en xenobiotica in de CNS-21. Dit is een voorwaarde voor betrouwbare neurale transmissie en functie, maar de bescherming van de CNS door de BBB beperkt de permeatie van synthetische drugs, de meeste peptiden en andere xenobiotica24,25, die potentieel introduceert problemen bij het karakteriseren van de potencies van kleine-molecuul modulatoren. De methode maakt gebruik van een eenvoudige transect verstoren deze barrière en klaar farmacologische toegang verschaffen tot de centrale synapsen.
De grootste kracht van de beschreven methodologie is de eenvoud, de reproduceerbaarheid en de relatief hoge gegevensdoorvoer capaciteit die inherent zijn aan dit systeem. Het protocol is relatief gemakkelijk te beheersen, de setup vereist weinig ruimte, en alleen een eerste financiële inspanning nodig is die is teruggebracht tot reagentia en verbruiksartikelen. De beschreven methode is verder volledig geamendeerd om vast te leggen van de centrale aflopende activiteit van de zenuw van het huis vliegen, Musca domestica26.
De nadere details verschaft in de bijbehorende video en tekst hebben verstrekt belangrijke stappen om te registreren van de activiteit en spike kwijting frequentie van de Drosophila CNS ex vivo. De werkzaamheid van de dissectie is de meest kritische aspect van de methode, omdat korte of paar aflopende neuronen zal verminderen de basislijn vuren tarief dat leiden grote verschillen tussen de duplo’s tot zal. Echter zodra de dissectie-techniek heeft gemasterd, zijn de gegevens die worden verzameld met deze…
The authors have nothing to disclose.
We zouden graag bedanken Ms. Rui Chen voor de dissectie en de beelden van de Drosophila CNS weergegeven in de cijfers.
Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A – Online Download | |
Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |