Drosophila Melanogaster 三龄幼虫中枢神经系统活动的电生理记录

摘要

本方案描述了一种记录黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中枢神经系统下行电活动的方法，可用于经济、便捷地检测药理学试剂、神经蛋白的基因突变和/或尚未明确的生理通路的作用。

摘要

目前大多数可用的杀虫剂均以神经系统为靶标，而无脊椎动物神经蛋白的基因突变往往会产生有害后果；然而，现有记录单个动物神经系统活动的方法成本高昂且费时费力。Drosophila melanogaster（黑腹果蝇）三龄幼虫中枢神经系统的吸吮电极制备方法，是一种可用于检测神经活性物质生理效应、确定不同神经通路在中枢神经系统活动中的生理作用，以及研究基因突变对神经功能影响的可行体系。这种离体制备仅需中等水平的解剖技巧和电生理学专业知识，即可获得可重复的昆虫神经元活动记录。随后，可将多种化学调节剂（包括肽类）直接溶于生理盐水中施加于神经系统，以测量其对中枢神经活动的影响。此外，还可单独或联合使用遗传学技术（如GAL4/UAS系统）与药理学试剂，以确定特定离子通道、转运蛋白或受体在节肢动物中枢神经系统功能中的作用。在此背景下，本文所述的检测方法对于以D. melanogaster为成熟模式生物的杀虫剂毒理学、昆虫生理学及发育生物学研究者具有重要意义。本实验方案的目标是描述一种电生理学方法，用于检测模式昆虫黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中枢神经系统的电活动，该方法适用于验证多种科学假设。

引言

该方法的总体目标是使研究人员能够快速测量模式昆虫中枢神经系统（CNS）的电发生活动。 黑腹果蝇该方法可靠、快速且成本低廉，适用于开展生理学和毒理学实验。. 中枢神经系统对生命至关重要，因此，为了理解或调控神经功能，研究人员已广泛探索了维持正常神经功能所必需的生理通路。对节肢动物中枢神经系统内信号通路的表征，推动了多种作用于无脊椎动物神经功能并导致其死亡、同时减少脱靶效应的杀虫剂化学类别的发现。因此，检测昆虫神经活动的能力在昆虫毒理学与生理学领域具有重要意义，因为神经系统是目前绝大多数投入使用杀虫剂的作用靶组织。¹然而，昆虫神经系统基础与应用知识的进一步发展仍需依赖先进的神经生理学技术，但这些技术的可行性受到限制，因为现有方法费时费力、成本高昂，昆虫神经细胞系资源有限，且大多数节肢动物的中枢突触难以接近。目前，对大多数昆虫神经蛋白的表征需要先将目标基因克隆并进行异源表达，才能开展后续的药物筛选和膜片钳电生理记录，例如昆虫内向整流钾离子通道的研究即采用此方法。²，昆虫雷诺丁受体³，蚊子电压敏感性K⁺ 通道⁴，以及其他研究者。为了减少对外源表达的需求以及避免功能性表达水平低下的问题，Bloomquist 及其同事旨在诱导培养细胞产生神经元表型 草地贪夜蛾 (Sf21）细胞作为一种新型杀虫剂发现方法^5,6这些方法为新化学体系的开发提供了有效途径，但往往在药理学试剂的表征、杀虫剂抗性机制的鉴定以及基本生理学原理的阐明方面造成难以克服的瓶颈。本文描述了一种 离体 一种能够从具有可塑遗传特性的模式昆虫中记录其电生理活动的方法^7,8,9 已知的神经复合体表达模式^10,11,12 以实现对神经水平耐药机制、新研发药物作用模式及其他毒理学研究的表征。

果蝇， D. melanogaster 是研究昆虫神经系统或杀虫剂作用机制的常用模式生物，并已被确立为毒理学研究中非常合适的模式生物¹³药理学^14,15神经生理学¹⁶和病理生理学的^17,18,19,20 脊椎动物的生理过程。 D.melanogaster 是一种完全变态昆虫，经历完全变态过程，包括幼虫期和蛹期，最终发育至生殖成熟的成虫期。在整个发育过程中，神经系统在不同生活阶段均经历显著的重塑，但本方法学将聚焦于幼虫期的中枢神经系统（CNS）。完全发育的幼虫中枢神经系统在解剖结构上较为简单，其胸部与腹部节段融合形成腹神经节，构成一系列重复且几乎相同的神经节单元^21,22下行运动神经起源于食道下神经节的尾端，并下行支配幼虫体壁肌肉和内脏器官。 图1 描述幼虫的宏观解剖结构 黑腹果蝇 中枢神经系统

Drosophila 的血脑屏障（BBB）在胚胎发育末期形成，由神经鞘下胶质细胞（SPG）构成²¹。SPG细胞形成大量类似伪足的突起，延展成连续且极为扁平的内皮样结构，覆盖整个 Drosophila 中枢神经系统（CNS）²³。Drosophila 的血脑屏障与脊椎动物的血脑屏障具有相似性，包括通过调控营养物质和外源性物质进入中枢神经系统来维持神经微环境的稳态²¹。这是确保神经信号可靠传递与正常功能的前提，但血脑屏障对中枢神经系统的保护作用也限制了合成药物、大多数肽类及其他外源性物质的渗透^24,25，这在评估小分子调节剂活性时可能带来潜在问题。本方法通过简单的切断操作破坏该屏障，从而实现药物对中枢突触的便捷干预。
所述方法的最大优势在于其操作简便、可重复性强以及系统本身具备相对较高的通量能力。该方案易于掌握，实验装置占用空间小，仅需一次性初期投入，后续成本仅限于试剂和耗材。此外，所描述的方法完全适用于记录家蝇（Musca domestica）的中枢下行神经活动²⁶。

方案

1. 仪器与材料

1. 准备所需的组分（列于下文） 材料表电生理设备的吸吮电极记录 果蝇 中枢神经系统
   注意：在开始实验之前，必须先构建用于解剖的腔室 果蝇 中枢神经系统，用于记录期间用生理盐水浸泡神经节。以下提供了灌流 chamber 构建的逐步说明。
2. 准备幼虫培养室。
   1. 使用加热板熔化黑蜡。
   2. 将2 mL熔化的石蜡倒入最大容积为2 - 2.5 mL的腔室中。
   3. 让石蜡冷却并凝固约2小时。
   4. 使用剃刀刀片在凝固的石蜡上刻出一个可容纳 500 µL 体积的孔洞，其表面积约为 0.5 cm²² 深度约为 0.25 cm。

2. 仪器设备与软件配置

注意：以下简要描述细胞外记录的设置。

1. 准备解剖和记录所需的设备。
   1. 将组织样本、显微镜、吸电极、显微操作器和光源置于法拉第笼内，以减少噪声并消除外部电场干扰（图2).
   2. 将接地线和正极导线连接（建议使用焊接）至屏蔽式鳄鱼夹，分别用于连接浴槽和微电极支架。
      注意：焊接并裸露的导线可用铝箔覆盖，以减少噪声。
   3. 将接地线和正极导线连接到交流/直流差分放大器的输入端1.
   4. 连接 数据采集系统 通过将BNC电缆从数据采集系统的输入1端口连接至放大器的通道1输出端，将信号接入交流/直流差分放大器。
      注意：建议在数据采集软件与放大器之间接入一个50/60 Hz噪声消除器。需要使用BNC T型连接器。
   5. 必要时，可通过将音频监视器的输入1连接至数据采集软件的输入1，将音频监视器纳入实验装置。
   6. 用生理盐水填充10 mL注射器，并将其连接至电极夹持器的压力端口。
      注意：确保注射器、Ag/AgCl 小球与电极开口之间无气泡存在。
2. 准备用于解剖和记录的软件。
   注意：软件设置方法的概述基于材料清单中列出的采集/分析软件 材料表 将对原始电信号进行数字化处理，并将数据转换为峰电位频率。然而，也可使用其他软件，以及多种记录转换方式。
   1. 打开采集/分析软件。
   2. 点击 "设置" 从主工具栏中选择 "通道设置，" 将打开一个对话框。
   3. 将总通道数减少至三个。
   4. 对于通道1，选择100 mV的范围。 
   5. 对于通道2，单击 "计算" 将打开一个下拉菜单的标签。选择 "循环测量" 将打开第二个对话框。
   6. 选择通道1作为信号源。然后在“测量”下拉菜单中选择“事件中的单位峰”。最后，在检测设置区域的下拉菜单中选择“简单阈值”。 
   7. 将电活动转换为以赫兹表示的频率图，需对3^rd 通道必须设置为算术模式：在输入窗口中输入 "1000*smoothsec(ch2,2)"然后在单位下拉菜单中选择赫兹。
      注意：可使用多种不同的记录装置完成成功的记录，但 "事件中的单位峰电位与简单阈值" 可能是最简单的，因为它允许针对每次单独记录的背景活动调整阈值。在以下设置下的记录 "自定义源输入" 假设记录之间的背景活动没有差异，可提高数据的可重复性。
   8. 关闭对话框以返回主屏幕。y 轴应以 Hz 为单位，x 轴以时间为单位。

3. 解剖并制备幼虫 Drosophila 中枢神经系统

注意：幼虫中枢神经系统解剖的方法在 Hafer 和 Schedl²⁷ 中已有清晰图示，但这些已发表的方法会缩短对测量峰电位频率至关重要的下行神经元的长度。本文另述一种解剖幼虫中枢神经系统的方法，可保留较长且完整的下行神经元。

1. 生理盐水配制。
   1. 配制解剖和记录用生理盐水，成分如下（单位：mM²⁸）：157 NaCl，3 KCl，2 CaCl₂，4 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸（HEPES）；用酸碱调节仪将pH值调至7.25。
2. 解剖幼虫期 Drosophila 中枢神经系统（CNS）。
   1. 从培养管中识别并取出一只正在爬行的三龄幼虫 Drosophila melanogaster，放入200 µL生理盐水中（图3A）。
   2. 用一对精细镊子夹住口钩，再用另一对镊子夹住幼虫的腹部（图3B）。
      注意：不要对腹部施加过大压力，以免撕裂幼虫薄的角质层。
   3. 轻柔地将口钩和腹部向相反方向拉扯，使幼虫尾部与头部区域分离，并暴露其内脏组织（图3C）。
      注意：中枢神经系统将与气管和消化道交织在一起。不要将中枢神经系统从任何组织上剪下，以避免切断下行的外周神经。
   4. 用镊子小心地将中枢神经系统从消化道和气管中分离出来（图3D）。
   5. 如有必要，可使用Vannas弹簧剪在大脑叶后方手动横切中枢神经系统，以破坏血脑屏障。
      注意：此操作应根据所用化学物质的理化性质决定。 图4A 中的红线为建议横切位置，图4B 显示了横切后保留完整的下行外周神经干。完成步骤3.2.5后，该横切的中枢神经系统即可用于实验。

4. Drosophila 中枢神经系统细胞外记录。

1. 准备中枢神经系统（CNS）以进行记录。
   1. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管拉制玻璃微电极，使其电阻达到 5–15 mΩ。
   2. 将切断的中枢神经系统放入含有 200 µL 生理盐水的石蜡腔室中。用连接在接地导线上的鳄鱼夹夹住一根未涂层的昆虫针，并将该针插入盐水中以完成电路。
   3. 使用显微操作器将电极对准切断的中枢神经系统的尾端。在接触外周神经干之前，通过调整采集/分析软件中的阈值水平来消除背景噪声的记录。
   4. 通过在注射器上施加轻微的负压，将任意可及的外周神经吸入吸电极中。
      注意：基础放电频率与被吸入电极的神经元数量相关，通常神经元越多，电极电阻越高。
2. 开始记录中枢神经系统下行神经活动的细胞外信号。
   1. 启动数据采集软件开始记录，并监测基础放电频率。在采集基础放电频率数据前，让放电速率稳定 5 分钟。
   2. 如果对照处理的放电模式不是类似于图5A所示的簇状放电模式，则应弃用该样本及记录。
      注意：放电模式的改变提示中枢模式发生器活动异常或不稳定，可能影响神经功能。
   3. 5 分钟后，加入 200 µL 生理盐水+溶剂，使腔室总体积达到 400 µL，开始记录对照放电频率。
   4. 在建立稳定基线后（3–5 分钟），吸出 200 µL 生理盐水，并加入 200 µL 溶解于生理盐水中的实验药物。
      注意：二甲基亚砜（DMSO）是脂溶性化合物推荐使用的溶剂，其终浓度不应超过 0.1% v/v。
   5. 按顺序依次施加药物浓度（从低到高），并对每种浓度记录一段特定时间（由研究者根据药物的化学性质决定²⁹）。在采集/分析软件中通过添加注释标记该药物施加的时间点，注释应包括药物名称和最终浓度。
      注意：解剖后 30–50 分钟内，中枢神经系统的放电活动会下降约 10–20%，因此应设置适当的未处理对照组，且药物处理时间不应超过此范围。
3. 分析数据。
   注意：可对采集的数据进行多种分析，例如动作电位簇的变化²⁹、峰电位波形的幅度和时程，以及药物处理后平均峰频率的确定^26,30,31,32。最常用的方法是评估药物在特定时间段内对平均峰频率的影响，如下所述。
   1. 通过选择整个感兴趣区域（即药物处理时间段），利用采集/分析软件主工具栏上的"Datapad"功能自动确定平均峰频率并制表。
   2. 将药物处理后的中枢神经系统平均峰频率与溶剂对照组（基线）的平均峰频率进行比较。按以下公式计算放电频率的变化百分比：（处理频率 / 基线频率）× 100。
   3. 利用每个浓度下的平均峰频率或相对于对照的放电百分比，使用标准绘图软件绘制浓度-反应曲线。
   4. 进行统计学分析（例如，非配对t检验），以确定不同时间点、浓度或药物处理之间的显著性差异。
      注意：生成和分析浓度-反应曲线主要有两种方法。第一种方法是每个样本仅使用一个浓度。在此方法中，单个浓度的峰频率相对于该样本的基线峰频率进行归一化。优点是记录时间较短，样本衰减减少；缺点是解剖时间增加，因为每种浓度需要 5–7 个独立的中枢神经系统样本，且平均数据集的误差条较大。第二种方法是每个样本依次施加多个浓度。在此方法中，3–5 个浓度的峰频率均相对于同一基线峰频率进行归一化。优点是解剖时间减少，药物浓度间重复性变异较小；缺点是要求药物起效快，且前一浓度的药物处理可能对后续化学处理产生未知影响。

结果

利用细胞外吸吮电极可稳定且可重复地记录源自黑腹果蝇（Drosophila）中枢神经系统的下行外周神经的自发性活动。离体并横断的黑腹果蝇（Drosophila）中枢神经系统（CNS）会产生周期性的爆发性放电模式，表现为持续约1-2秒的放电活动，随后是约1秒的接近静息状态。例如，中枢神经系统在0.5-1秒内处于接近静息状态（1-2 Hz），随后出现约1秒的爆发性放电（100-400 Hz），然后再次回到0.5-1秒的接近静息状态（1-2 Hz）（图5A）。该放电模式每2-3秒重复一次。当阈值设定略高于基线噪声时，在3-5分钟的时间段内，黑腹果蝇（Drosophila）中枢神经系统的平均峰电位发放频率约为20-50 Hz。基线放电频率与被吸入电极的外周神经元数量以及电极孔口与腹神经节之间形成的密封程度相关。重要的是，终浓度为0.1%的化学溶剂DMSO处理不会改变黑腹果蝇（Drosophila）中枢神经系统的峰电位发放频率（

讨论

相关视频和文本中提供的细节阐述了记录果蝇（Drosophila）中枢神经系统（CNS）离体（ex vivo）活动及放电频率的关键步骤。其中，解剖效率是该方法最关键的环节，因为降支神经元过短或数量过少会降低基础放电频率，从而导致重复实验之间出现较大变异。然而，一旦掌握了解剖技术，本实验所获得的数据具有高度可重复性，并适用于多种研究领域。对所述方法的一种改进是引入自动灌流系统，以避免手动将生理盐水和化学溶液通过移液器加入中枢神经系统记录腔室。采用灌流系统可减少记录过程中对中枢神经系统的扰动，而这种扰动在使用手动移液器加药时偶有发生。

该电生理学方法利用该制备手段在药物/杀虫剂发现研究中的应用价值。此外，该制备手段适用于课堂教学，用于演示神经生理学的基本概念。该方法所需经费投入相对较低，准备时间短，同时可提供稳定可靠的记录，可用于展示药物对果蝇中枢神经系统功能的影响。例如，记录装置的经费负担为初始成本约10,000美元，后续成本较低（例如， 生理盐、果蝇品系保种 等等。此外，从CNS制备到首次记录所需时间约为10分钟...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Drosophila melanogaster（品系 OR）	布卢明顿果蝇资源中心	2376
隔振台	Kinetic Systems	9200 系列
法拉第笼	Kinetic Systems	N/A
带臂式体视显微镜	Nikon	SMZ800N	可使用多种显微镜；带臂支架至关重要
交直流差分放大器	ADInstruments	AM3000H	可使用型号 1700 替代型号 3000
音频监测器	ADInstruments	AM3300
Hum Bug 噪声消除器	A-M Systems	726300
数据采集系统（PowerLab）	ADInstruments	PL3504	可使用多种 PowerLab 型号
Lab Chart Pro 软件	ADInstruments	N/A - 在线下载
光纤光源	Edmund Optics	89-740	可使用不同光源，但光纤光源适应性最强
显微操作器	World Precision Instruments	M325
微电极夹持器	World Precision Instruments	MEH715	其他型号亦可接受
BNC 电缆	World Precision Instruments	根据尺寸选择多种规格
玻璃毛细管	World Precision Instruments	PG52151-4
微电极拉制仪	Sutter Instruments	P-1000	也可使用 Narashige PC-100
黑色石蜡	Carolina Biological Supply	974228
未镀层昆虫针，#2 号	Bioquip	1208S2
精细镊子	Fine Science Tools	11254-20
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15000-03