Evaluering af biomarkører i gliom af Immunhistokemi på Paraffin-Embedded 3D gliom Neurosphere kulturer
Summary
Neurospheres dyrkes som 3D kulturer udgør et kraftfuldt værktøj til at studere gliom biologi. Her præsenterer vi en protokol for at udføre Immunhistokemi samtidig bevare 3D-struktur af gliom neurospheres gennem integrering af paraffin. Denne metode gør det muligt for karakterisering af gliom neurosphere egenskaber som stemness og neurale differentiering.
Abstract
Analyse af protein udtryk i gliom er relevant for flere aspekter i studiet af dens patologi. Mange proteiner er blevet beskrevet som biomarkører med programmer i diagnose, prognose, klassificering, tilstand af tumor progression og celle differentiering stat. Disse analyser af biomarkører er også nyttige til at karakterisere tumor neurospheres (NS) genereret fra gliom patienter og gliom modeller. Tumor NS giver en værdifuld in vitro- model for at vurdere forskellige funktioner af tumor, som de afledes og kan mere præcist spejl gliom biologi. Her beskriver vi en detaljeret metode til at analysere biomarkører i tumor NS ved hjælp af Immunhistokemi (IHC) på paraffin-indlejret svulst NS.
Introduction
Gliomer er primære solide tumorer i det centrale nervesystem, klassificeret efter deres fænotypiske og genotypiske karakteristika ifølge World Health Organization1. Denne klassificering inkorporerer tilstedeværelsen eller fraværet af driver mutationer, som repræsenterer en attraktiv kilde af biomarkører2. Biomarkører er biologiske karakteristika, der kan måles og evalueres for at angive normale og patologiske processer, samt farmakologiske svar til en terapeutisk intervention3. Biomarkører kan påvises i tumor væv og celler, der stammer fra gliom, aktivering af sin biologiske karakterisering i forskellige aspekter. Nogle eksempler på gliom biomarkører muterede isocitrat dehydrogenase 1 (IDH1), en mutant enzym karakteristisk for lavere-grade gliomer forbundet med bedre prognose4. Muterede IDH1 udtrykkes ofte i kombination med TP53 og alpha-thalassæmi/mental retardering syndrom X-linked (ATRX)-uvirksomme mutationer, definere en specifik gliom subtype4,5. ATRX-uvirksomme mutationer også forekomme i 44% af pediatric high-grade gliomer2,6 og har været forbundet med aggressive tumorer og genomisk ustabilitet6,7. Derudover er pediatric diffuse iboende pontine gliomer (DIPG) differentieret i undergrupper efter tilstedeværelsen eller fraværet af en K27M mutation i Histon H3 gen H3F3A eller i HIST1H3B/C gen1,6. Derfor indførelsen af Molekylær karakterisering tillader inddeling, undersøgelse og behandling af gliomer som separate enheder, som tillader mere udvikling af mere målrettede behandlinger for hver undertype. Derudover kan analyse af biomarkører bruges til at vurdere forskellige biologiske processer såsom apoptose8, autophagy9, celle cyklus progression10, celle spredning11og Celledifferentiering12 .
Gensplejsede dyremodeller, der nærer de genetiske læsioner i menneskelige kræftformer er vigtige for studiet af signalering veje, der mægle sygdomsprogression. Vores laboratorium har implementeret brugen af sovende skønhed (SB) transposase system til at udvikle genetisk modificerede musemodeller af gliom husly specifikke mutationer, at sammenfatte menneskelige gliom undertyper13,14. Disse genetisk modificerede musemodeller bruges til at generere tumor-afledte NS, som aktiverer in vitro- undersøgelser i en 3D system, spejling Sukkerøkonomien i hovedtræk i tumorer in situ15. Orthotopical transplantation af NS ind i musene kan generere sekundære tumorer, der bevarer funktioner af den primære tumor og efterligne de histopatologiske, genomiske og fænotypiske egenskaber af den tilsvarende primære tumor15.
I serumfrit kultur, hjerne tumorceller med stamcelle egenskaber kan blive beriget og epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblast vækstfaktorer (FGF), de kan dyrkes som enkelt celle-afledte kolonier som NS kulturer. I dette selektive kultur system dør de fleste differentiering eller differentierede celler hurtigt, mens stamceller Divider og danner de cellulære klynger. Dette giver mulighed for generation af en NS kultur, der vedligeholder gliom tumor funktioner16,17,18. Gliom NS kan bruges til at evaluere flere aspekter af tumor biology, herunder analyse af biomarkører, som har applikationer i diagnose, prognose, klassificering, tilstand af tumor progression og celle differentiering stat. Her, vi detalje en protokol til at generere gliom NS og Integrer 3D kulturer i paraffin anvendes til IHC farvning. En fordel ved fastsættelse og indlejring gliom NS er, at morfologi af NS er vedligeholdt bedre i forhold til de konventionelle cytospin metode19, i hvilke gliom NS udsættes for stressende manipulation for celle dissociation og blive fladtrykt. Derudover slukker indlejring enhver endogene fluorophore udtryk fra gensplejsede tumor NS, aktivering af farvning på tværs af de fluorescerende spektre. Det overordnede mål med denne metode er at bevare 3D-struktur af gliom celler gennem en paraffin indlejring proces og aktiverer karakterisering af gliom neurospheres ved hjælp af Immunhistokemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel detaljer vi en alsidig og reproducerbar metode til at udføre Immunhistokemi på paraffin-embedded gliom NS, som fastholder den karakteristiske 3D-struktur af tumorceller vokser i hjernen in situ. Denne teknik besidder følgende fordele over ved hjælp af celler belagt på glas eller plast overflader: Jeg) bevarelse af 3D-struktur af NS; II) undgå stress af celle dissociation før analyse af protein udtryk; III) quenching af enhver endogene fluorophore udtryk fra gensplejsede tumor NS, aktiverin…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed/National Institute af neurologiske & streg (NIH/NINDS) tilskud R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 til M.G.C.; NIH/NINDS tilskud R01-NS076991 R01-NS082311 og R01-NS096756 til P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Afdeling Neurokirurgi; Leah’s Happy Hearts til M.G.C. og P.R.L.; og RNA biomedicin Grant F046166 at M.G.C. F.M.M. er støttet af en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. blev støttet af et Fulbright-argentinske Ministeriet for sport og uddannelse Fellowship.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
Referencias
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Investigación sobre el cáncer. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
