Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

Resumen

Neuroesferas crecidos como culturas 3D constituyen una poderosa herramienta para estudiar la biología del glioma. Aquí presentamos un protocolo para realizar inmunohistoquímica manteniendo la estructura 3D de glioma neuroesferas a través de la inclusión en parafina. Este método permite la caracterización de propiedades de desarrolló de glioma como troncalidad y diferenciación de los nervios.

Resumen

Análisis de expresión de proteínas en glioma es relevante por varios aspectos en el estudio de su patología. Se han descrito numerosas proteínas como biomarcadores con aplicaciones en diagnosis, pronóstico, clasificación, estado de progresión del tumor y estado de diferenciación celular. Estos análisis de biomarcadores también son útiles para caracterizar el tumor neuroesferas (NS) generados a partir de pacientes de glioma y modelos de glioma. Tumor NS proporcionan un modelo valioso en vitro para evaluar diversas características de tumor de que se derivan y pueden más exactamente espejo glioma biología. Aquí describimos un método detallado para analizar biomarcadores en tumor NS mediante inmunohistoquímica (IHQ) en tumor de parafina-encajado NS.

Introducción

Los gliomas son los tumores sólidos primarios del sistema nervioso central clasificados por sus características fenotípicas y genotípicas según la Organización Mundial de la salud¹. Esta clasificación incorpora la presencia o ausencia de mutaciones del conductor, que representan una atractiva fuente de biomarcadores². Biomarcadores son características biológicas que pueden ser medidas y evaluadas para indicar procesos normales y patológicos, así como la respuesta farmacológica a una intervención terapéutica³. Biomarcadores se pueden detectar en el tejido del tumor y las células derivadas de glioma....

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.

1. generación de neuroesferas de Tumor cerebral derivado de un modelo de ratón

1. Antes del procedimiento de la disección, preparar medios de células madre neurales (NSC medios: DMEM/F12 con 1 x B27 suplemento, suplemento de x N2 1, normocin x 1 y 1 x antibiótico/antimicótico con recombinante humano EGF y basic-FGF a concentraciones de 20 ng/mL de cada una). Llene un tubo de 1,5 mL con 300 μL de medio de NSC y reservamos para más adelante.
2. Seleccione un ratón con un tumor grande.....

Resultados

Para monitorear el desarrollo de tumores y evaluar si el tumor ha alcanzado el tamaño necesario para generar NS, analizamos la luminiscencia emitida por tumores mediante bioluminiscencia. Esto permite el estudio de la eficiencia de la transducción de señales en los cachorros y la progresión del tumor por la señal de luminiscencia de luciferasa (figura 1A y 1B). Cuando el tamaño de tumor alcanza una señal de 1 x 10⁷.......

Discusión

En este artículo detallamos un método reproducible y versátil para realizar inmunohistoquímica en parafina-encajado glioma NS, que mantienen la característica estructura 3D de las células del tumor en el cerebro in situ. Esta técnica posee las siguientes ventajas sobre usar células plateadas en superficies de plástico o vidrio: i) preservación de la estructura 3D del NS; II) evitando de la tensión de disociación celular antes del análisis de expresión de la proteína; III) amortiguamiento de cualquier expresión d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cuchilla de micrótomo recubierta HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtomo RM 2135	Leica	MR2135
Solución de formol, tamponada neutra, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
anti-ATRX policlonal de conejo	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, dilución 1:250
Anti-Ki-67 policlonal de conejo Abcam		Ab15580	IHC, dilución 1:1000
Conejo policlonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, dilución 1:500
Cabra policlonal anti-conejo biotina conjugada Dako		E0432	IHC, dilución 1:1000
Vectastain Elite ABC Kit HRP	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical BDB2004	L/precio hasta 12/18
N-2 Suplemento	ThermoFisher	17502048
N-27 Suplemento	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Solución de desprendimiento de células	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 tratado Matraz	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 tratado Matraz	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS medios
HBSS	GibcoTM	14175-103	solución salina equilibrada
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 ratón

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