以三维培养方式生长的神经球是研究胶质瘤生物学的有力工具。本文介绍了一种在通过石蜡包埋保持胶质瘤神经球三维结构的前提下进行免疫组织化学分析的实验方案。该方法可用于表征胶质瘤神经球的特性，如干性及神经分化能力。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
胶质瘤中蛋白质表达的分析在其病理学研究的多个方面具有重要意义。已有多种蛋白质被描述为生物标志物，可用于诊断、预后、分类、肿瘤进展状态以及细胞分化状态。这些生物标志物的分析也有助于表征来源于胶质瘤患者及胶质瘤模型的肿瘤神经球（NS）。肿瘤神经球提供了宝贵的 体外 用于评估其来源肿瘤不同特征的模型，可更准确地模拟胶质瘤生物学特性。本文详细描述了一种在石蜡包埋的肿瘤神经球（tumor NS）上通过免疫组织化学（IHC）分析生物标志物的方法。
引言
胶质瘤是原发性中枢神经系统实体瘤，根据世界卫生组织的标准，按照其表型和基因型特征进行分类1。该分类体系纳入了驱动突变的存在与否，这些突变是极具潜力的生物标志物来源2。生物标志物是指可测量和评估的生物学特征，可用于指示正常和病理生理过程，以及对治疗干预的药理学反应3。生物标志物可在胶质瘤来源的肿瘤组织和细胞中被检测到，从而实现对胶质瘤多方面的生物学特征分析。一些胶质瘤生物标志物的例子包括异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）的突变，这是一种常见于低级别胶质瘤的突变酶，与较好的预后相关4。突变型IDH1常与TP53以及X连锁α-地中海贫血/智力障碍综合征（ATRX）失活突变共同表达，从而定义了一种特定的胶质瘤亚型4,5。ATRX失活突变也出现在44%的儿童高级别胶质瘤中2,6，并与侵袭性肿瘤和基因组不稳定性相关6,7。此外，儿童弥漫性内生性桥脑胶质瘤（DIPG）可根据组蛋白H3基因H3F3A或HIST1H3B....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述所有方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 来自小鼠模型的脑肿瘤神经球的制备
- 解剖操作前，配制神经干细胞培养基（NSC 培养基：DMEM/F12 添加 1× B27 补充剂、1× N2 补充剂、1× 诺莫辛（normocin）和 1× 抗生素/抗真菌剂，并加入浓度均为 20 ng/mL 的人重组 EGF 和 bFGF）。取 1.5 mL 离心管，加入 300 µL NSC 培养基，留待后续使用。
- 选择带有较大肿瘤的小鼠。
注意：若注射的质粒或病毒编码荧光素酶，可通过生物发光监测肿瘤大小。通常，较大肿瘤的生物发光强度超过 > 106 光子/秒/平方厘米/球面度（photons/s/cm2/sr）。 - 通过过量异氟烷实施安乐死：将浸有异氟烷的滤纸放入安乐死舱内，避免与小鼠直接接触，以防刺激。待小鼠无足底反射（通常需 5–10 分钟）后，断头处死，并按照 Calinescu et al.13 所述方法解剖脑组织。
- 若肿瘤具有荧光特性，使用配备荧光光源的体视显微镜识别脑内肿瘤组织。用精细镊子将肿瘤（通常直径为 5–7 mm）从正常脑组织中分离出来。
- 将分离的肿瘤组织放入含有 NSC 培养基的 1.5 mL 离心....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为监测肿瘤发育并评估肿瘤是否已达到生成神经球（NS）所需的大小，我们利用生物发光技术分析肿瘤发出的光信号。该方法可通过荧光素酶的发光信号来研究幼鼠中的转导效率及肿瘤进展图1A 和 1B）。当肿瘤大小达到 1 x 10 的信号时7 光子/秒/平方厘米/球面度 (图1B），便可对脑组织进行神经球（NS）生成处理。该系统的另一优势在于，可在用于基因递送和肿瘤生成的质粒中加入不同荧光蛋白的编码序列。随后，我们可利用配备荧光灯的体视显微镜确认插入的遗传修饰是否表达，图1C）。由野生型IDH1（wt-IDH1）生成的NS（图1D）和 mIDH1（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文详细介绍了一种在福尔马林固定石蜡包埋的胶质瘤神经球（NS）上进行免疫组织化学的通用且可重复的方法，该方法能够保持肿瘤细胞在脑内原位生长所特有的三维结构。in situ。与将细胞接种于玻璃或塑料表面的方法相比，该技术具有以下优势：i）保留神经球的三维结构；ii）避免在分析蛋白表达前因细胞解离而产生的应激影响；iii）淬灭基因工程改造的肿瘤神经球中任何内源性荧光蛋白的表达，从而实现跨越整个荧光光谱的染色；iv）可长期保存。
该技术的关键步骤是确保细胞在琼脂糖中充分重悬，以保证细胞均匀分布，避免成团聚集。该技术的一个局限性在于免疫组化染色前所需的细胞培养和神经球（NS）处理步骤较为耗时。第二个局限性是执行该方法所需的细胞数量较多。如果细胞数量少于1 × 106个，则每个切片视野中的神经球簇细胞数量将过少。因此，若胶质瘤细胞生长缓慢，可能难以达到理想的细胞数量。我们使用了一个汇合的T-25培养瓶，其中含有至少3.0 × 106个细胞。所用细胞数量可根据需要调整；但必须获得大小合适的神经球沉淀，以满足包埋操作的要求。此后，包埋.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所资助 & 美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）资助项目 R37-NS094804、R01-NS074387、R21-NS091555（资助 M.G.C.）；NIH/NINDS 资助项目 R01-NS076991、R01-NS082311 和 R01-NS096756（资助 P.R.L.）；NIH/NINDS R01-EB022563；1UO1CA224160；神经外科系；Leah's Happy Hearts 基金（资助 M.G.C. 和 P.R.L.）；RNA 生物医学资助项目 F046166（资助 M.G.C.）。F.M.M. 获 NIH/NINDS F31 资助项目 F31NS103500 支持。J.P. 获富布赖特-阿根廷体育与教育部奖学金支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 涂层切片刀 HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| 切片机 RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| 兔多克隆抗ATRX抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC，1:250 稀释 |
| 兔多克隆抗Ki-67抗体 | Abcam | Ab15580 | IHC，1:1000 稀释 |
| 兔多克隆抗OLIG2抗体 | Millipore | AB9610 | IHC，1:500 稀释 |
| 山羊多克隆抗兔生物素偶联二抗 | Dako | E0432 | IHC，1:1000 稀释 |
| Vectastain Elite ABC HRP 试剂盒 | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB 显色试剂盒 | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 添加剂 | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 添加剂 | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® 细胞解离液 | Biolegend | 423201 | |
| 低熔点琼脂糖 LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml 离心管 | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 处理培养瓶 | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 处理培养瓶 | 25-207 | |
| DMEM/F12 培养基 | Gibco | 11330-057 | NS 培养基 |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | 平衡盐溶液 |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 小鼠 |
参考文献
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
