需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过石蜡包埋的三维胶质瘤神经球培养物免疫组织化学评估胶质瘤生物标志物

7.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58931

⸱

2019年1月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Cell & Developmental Biology, University of Michigan, 3INIBIOLP, Histology B-Pathology B, School of Medicine, UNLP

本文内容

摘要

以三维培养方式生长的神经球是研究胶质瘤生物学的有力工具。本文介绍了一种在通过石蜡包埋保持胶质瘤神经球三维结构的前提下进行免疫组织化学分析的实验方案。该方法可用于表征胶质瘤神经球的特性，如干性及神经分化能力。

摘要

胶质瘤中蛋白质表达的分析在其病理学研究的多个方面具有重要意义。已有多种蛋白质被描述为生物标志物，可用于诊断、预后、分类、肿瘤进展状态以及细胞分化状态。这些生物标志物的分析也有助于表征来源于胶质瘤患者及胶质瘤模型的肿瘤神经球（NS）。肿瘤神经球提供了宝贵的 体外 用于评估其来源肿瘤不同特征的模型，可更准确地模拟胶质瘤生物学特性。本文详细描述了一种在石蜡包埋的肿瘤神经球（tumor NS）上通过免疫组织化学（IHC）分析生物标志物的方法。

引言

胶质瘤是原发性中枢神经系统实体瘤，根据世界卫生组织的标准，按照其表型和基因型特征进行分类1。该分类体系纳入了驱动突变的存在与否，这些突变是极具潜力的生物标志物来源2。生物标志物是指可测量和评估的生物学特征，可用于指示正常和病理生理过程，以及对治疗干预的药理学反应3。生物标志物可在胶质瘤来源的肿瘤组织和细胞中被检测到，从而实现对胶质瘤多方面的生物学特征分析。一些胶质瘤生物标志物的例子包括异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）的突变，这是一种常见于低级别胶质瘤的突变酶，与较好的预后相关4。突变型IDH1常与TP53以及X连锁α-地中海贫血/智力障碍综合征（ATRX）失活突变共同表达，从而定义了一种特定的胶质瘤亚型4,5。ATRX失活突变也出现在44%的儿童高级别胶质瘤中2,6，并与侵袭性肿瘤和基因组不稳定性相关6,7。此外，儿童弥漫性内生性桥脑胶质瘤（DIPG）可根据组蛋白H3基因H3F3A或HIST1H3B/C是否存在K27M突变进一步划分为不同亚组1,6。因此，分子特征分析的引入使得胶质瘤能够被划分为不同的独立类型，从而促进对各类亚型的深入研究和针对性治疗，有助于为每种亚型开发更精准的疗法。此外，生物标志物的分析还可用于评估多种生物学过程，如细胞凋亡8、自噬9、细胞周期进程10、细胞增殖11和细胞分化12。

携带人类癌症中常见基因突变的基因工程动物模型，对于研究介导疾病进展的信号通路至关重要。本实验室已采用睡美人（Sleeping Beauty, SB）转座酶系统，建立携带特定突变的基因工程小鼠胶质瘤模型，以模拟人类胶质瘤的不同亚型。13,14这些基因工程小鼠模型可用于生成肿瘤来源的神经球（NS），从而能够 体外 在三维系统中进行的研究，模拟了肿瘤中存在的显著特征 原位15此外，将神经球（NS）原位移植到小鼠体内可生成保留原发肿瘤特征的继发性肿瘤，并模拟相应原发肿瘤的组织病理学、基因组学和表型特性。15.

在无血清培养条件下，可富集具有干细胞特性的脑肿瘤细胞，并在表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）存在时，以单细胞来源的克隆形式（如NS培养物）进行培养。在此选择性培养体系中，大多数正在分化或已分化的细胞会迅速死亡，而干细胞则持续分裂并形成细胞簇。这使得能够建立并维持保留胶质瘤肿瘤特征的NS培养物16,17,18。胶质瘤NS可用于评估肿瘤生物学的多个方面，包括可用于诊断、预后判断、分类、肿瘤进展状态以及细胞分化状态的生物标志物分析。本文详细描述了一种制备胶质瘤NS并将其三维培养物包埋于石蜡中用于免疫组化（IHC）染色的实验方案。固定并包埋胶质瘤NS的一个优势在于，相较于传统的细胞离心涂片法19，NS的形态结构得以更好地保存；在传统方法中，胶质瘤NS需经历剧烈的细胞解离操作，导致细胞结构压平变形。此外，石蜡包埋可淬灭经基因工程改造的肿瘤NS中内源性荧光蛋白的表达，从而实现跨越整个荧光光谱的染色检测。本方法的总体目标是通过石蜡包埋过程保持胶质瘤细胞的三维结构，并利用免疫组化技术对胶质瘤神经球进行表征分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本文所述所有方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 来自小鼠模型的脑肿瘤神经球的制备

  1. 解剖操作前，配制神经干细胞培养基（NSC 培养基：DMEM/F12 添加 1× B27 补充剂、1× N2 补充剂、1× 诺莫辛（normocin）和 1× 抗生素/抗真菌剂，并加入浓度均为 20 ng/mL 的人重组 EGF 和 bFGF）。取 1.5 mL 离心管，加入 300 µL NSC 培养基，留待后续使用。
  2. 选择带有较大肿瘤的小鼠。
    注意：若注射的质粒或病毒编码荧光素酶，可通过生物发光监测肿瘤大小。通常，较大肿瘤的生物发光强度超过 > 106 光子/秒/平方厘米/球面度（photons/s/cm2/sr）。
  3. 通过过量异氟烷实施安乐死：将浸有异氟烷的滤纸放入安乐死舱内，避免与小鼠直接接触，以防刺激。待小鼠无足底反射（通常需 5–10 分钟）后，断头处死，并按照 Calinescu et al.13 所述方法解剖脑组织。
  4. 若肿瘤具有荧光特性，使用配备荧光光源的体视显微镜识别脑内肿瘤组织。用精细镊子将肿瘤（通常直径为 5–7 mm）从正常脑组织中分离出来。
  5. 将分离的肿瘤组织放入含有 NSC 培养基的 1.5 mL 离心管（步骤 1.1）。使用适配离心管内壁的一次性塑料研磨杵，施加轻柔压力，将肿瘤组织匀浆化。
  6. 为解离细胞团块，加入 1 mL 无酶解离液，在 37 °C 下孵育 5 分钟。
  7. 将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤，并用 20 mL NSC 培养基冲洗细胞筛。
  8. 以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，根据沉淀物大小，将沉淀重悬于 6 mL 或 15 mL NSC 培养基中。
  9. 将肿瘤细胞悬液接种至 T-25 或 T-75 培养瓶中，在 37 °C、含 95% 空气和 5% CO2 的组织培养孵箱中进行培养。
  10. 3 天后，转移健康悬浮的神经球（NS），并重新接种至 T-25 或 T-75 组织培养瓶中。如有需要，向培养物中补充更多 NSC 培养基。
    注意：通常细胞群体为混合状态，部分细胞死亡，部分细胞贴壁，另一部分则形成悬浮于培养基中的神经球（NS）

2. NS 细胞的维持与传代

注意：防止过度生长，并将细胞维持在相对较高的密度。融合度通过类球体大小来判断（大型类球体的黑色中心表示过度生长）。神经球（NS）的生长速率取决于用于生成肿瘤的癌基因。

  1. 当NS培养物达到汇合状态时，将其收集至无菌离心管中，在300 × g条件下离心5分钟，以沉淀NS细胞。
  2. 弃去上清液，加入1 mL细胞解离溶液，用移液器吹打重悬沉淀。
  3. 在37 °C孵育5分钟，每隔2分钟轻弹管壁以促进细胞解离。
    注意：当NS细胞达到汇合状态时，通常可在肉眼下观察到微小的白色球状结构。为确保充分解离，所有可见的NS球体必须完全消失。
  4. 加入5 mL 1× HBSS溶液，反复吹打数次。在300 × g条件下离心5分钟，收集细胞。弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL添加了重组EGF和碱性-FGF的NSC培养基中。
  5. 将1 mL细胞悬液加入15 mL NSC培养基中，于37 °C、含95%空气和5% CO2的组织培养孵箱中的T-75培养瓶 内进行培养。
  6. 每3天添加一次生长因子（EGF和碱性-FGF）。若培养基变为浅橙色而细胞尚未达到汇合状态，则需更换培养基。操作时，在300 × g条件下离心4分钟，弃去上清，将细胞重悬于添加了生长因子的NSC培养基中。
    注意：根据所形成细胞沉淀的大小，可能需要将细胞分种至更多培养瓶中。

3. 神经球长期保存的冻存

  1. 当NS培养物达到融合状态时，按照步骤2.1-2.4所述方法解离细胞。一旦细胞沉淀重悬于HBSS中，取出一份 aliquot 并进行细胞计数。
  2. 以300 × g离心4分钟，并尽可能吸除上清液。
  3. 将沉淀重悬于冻存液（热灭活FBS，10% DMSO）中。建议每毫升冻存液中加入1 × 106至3 × 106个细胞，分装至每支冻存管。
  4. 根据需要将重悬的细胞分装至若干冻存管中，并通过逐步降温的方式缓慢冷却：先将冻存管转移至冰上，随后置于-20 °C，再转移至-80 °C，最后于次日移入液氮储存容器中。

4. 肿瘤NS的固定

  1. 将肿瘤神经球（NS）在T-25培养瓶中培养2-3天，直至细胞达到汇合状态（约3 × 106个细胞）。从至少一个汇合的T-25培养瓶中收集肿瘤神经球至15 mL锥形管中，在300 × g条件下离心5分钟，形成细胞沉淀。
  2. 将沉淀重悬于1 mL 10%福尔马林中，室温（RT）放置10分钟。加入5 mL 1× HBSS，并按照步骤3.2的方法离心收集细胞沉淀。重复此步骤一次。
  3. 将含有细胞沉淀的15 mL锥形管置于冰上。

5. 肿瘤NS的石蜡包埋

  1. 将洗涤后的NS沉淀重悬于500 µL 2%温热液体琼脂糖中，轻轻吹打混匀。
  2. 立即将含NS的琼脂糖置于冰上，直至琼脂糖聚合。取出含有NS的琼脂糖块，将聚合后的含NS琼脂糖块放入组织处理盒中（图2）。
  3. 继续进行组织处理（使用自动石蜡处理仪）和石蜡包埋（使用包埋工作站）。

6. 石蜡包埋神经组织切片

  1. 将水浴锅温度设置为 42 °C，并使用两把画笔小心地将刀片安装到切片机上，确保刀片水平。此刀片仅用于修块。
  2. 将石蜡包埋块放置在切片机上。用非惯用手按压位于左侧的控制切片厚度的杠杆，将其压至第二个挡位，即指示厚度为 30 µm 的位置。
  3. 用右手转动粗动手轮开始修块（i.e., 去除多余的石蜡），直至暴露样品表面。此时，将控制修块厚度的杠杆释放至 10 μm 或 5 μm。当样品表面完全暴露后，停止修块。
  4. 在冰盒中放入冰块，并加入适量水，使石蜡块置于冰上时，水能在其周围形成一层薄膜，防止石蜡块直接接触冰面。将石蜡块在冰上孵育 20 分钟。
  5. 弃去旧刀片，换上新刀片用于切片。用纱布将石蜡块擦干，然后将其放回切片机上。
  6. 用非惯用手取一对弯头镊子，用于拉出石蜡带。右手旁放置一把湿润的画笔，用于将石蜡带转移至水浴锅中。用右手快速转动粗动手轮开始切片，同时用左手的镊子夹住石蜡带。
  7. 用湿润的画笔将石蜡带转移至水浴锅中。
  8. 利用镊子的弧度，将镊子轻轻置于两片石蜡切片之间，轻推使切片彼此分离，从而将切片分开。
    注意：该操作应完全在石蜡切片表面进行，切勿向下按压切片。
  9. 用湿润的画笔将分离的石蜡切片推至带正电荷的粘附载玻片上。
  10. 将载玻片置于化学通风橱内过夜干燥，然后收入载玻片盒中储存。载玻片的储存方式取决于所进行的染色类型。

7. 石蜡包埋NS的免疫组织化学（IHC）

  1. 将切片置于金属架中，于60 °C孵育20分钟，以熔化石蜡。
  2. 将切片在室温下置于复水系列溶液中进行脱蜡：二甲苯中孵育3次，每次5分钟；100%乙醇中孵育2次，每次2分钟；95%乙醇中孵育2次，每次2分钟；70%乙醇中孵育1次，每次2分钟；去离子水中孵育1次，持续2分钟。此后，将切片保持在自来水内直至抗原修复步骤，因为干燥会导致非特异性抗体结合。
  3. 将切片在柠檬酸缓冲液（10 mM 柠檬酸，0.05% 非离子型去污剂，pH 6）中于125 °C孵育30秒，随后在90 °C孵育10秒。待其冷却后，用蒸馏水冲洗切片5次。
  4. 在室温下用0.3% H2O2孵育切片30分钟。
  5. 用洗涤缓冲液（TBS中含0.025%去污剂）轻轻振荡洗涤切片3次，每次5分钟。
  6. 在室温下用封闭液（TBS中含10%马血清和0.1% BSA）孵育切片30分钟。
  7. 将切片置于湿盒中，在4 °C下与用稀释液（TBS中含0.1% BSA）配制的一抗共同孵育过夜。随后用洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤切片3次，每次5分钟。
  8. 在室温下用用稀释液配制的生物素化二抗孵育切片1小时。随后用洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤切片3次，每次5分钟。
  9. 在室温避光条件下用亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合物孵育切片30分钟。随后用洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤切片3次，每次5分钟。
  10. 在室温下用DAB-H2O2底物显色液孵育切片2–5分钟。
  11. 用自来水冲洗3次。将切片浸入苏木精染液中1–2秒进行复染，然后用自来水彻底冲洗直至背景清晰。
  12. 按以下步骤对切片进行脱水：在蒸馏水中孵育2分钟；在80%乙醇中浸入3次；在95%乙醇中孵育2次，每次2分钟；在100%乙醇中孵育2次，每次2分钟；最后在二甲苯中孵育3次，每次3分钟。
  13. 用基于二甲苯的封片剂封片，并将切片平放于室温下干燥，直至可用于成像。       注意：若进行3,3'-二氨基联苯胺（DAB）染色，切片可在室温下保存。若进行免疫荧光染色，则切片应避光保存于-20 °C，以减少光漂白。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为监测肿瘤发育并评估肿瘤是否已达到生成神经球（NS）所需的大小，我们利用生物发光技术分析肿瘤发出的光信号。该方法可通过荧光素酶的发光信号来研究幼鼠中的转导效率及肿瘤进展图1A 和 1B）。当肿瘤大小达到 1 x 10 的信号时7 光子/秒/平方厘米/球面度 (图1B），便可对脑组织进行神经球（NS）生成处理。该系统的另一优势在于，可在用于基因递送和肿瘤生成的质粒中加入不同荧光蛋白的编码序列。随后，我们可利用配备荧光灯的体视显微镜确认插入的遗传修饰是否表达，图1C）。由野生型IDH1（wt-IDH1）生成的NS（图1D）和 mIDH1（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文详细介绍了一种在福尔马林固定石蜡包埋的胶质瘤神经球（NS）上进行免疫组织化学的通用且可重复的方法，该方法能够保持肿瘤细胞在脑内原位生长所特有的三维结构。in situ。与将细胞接种于玻璃或塑料表面的方法相比，该技术具有以下优势：i）保留神经球的三维结构；ii）避免在分析蛋白表达前因细胞解离而产生的应激影响；iii）淬灭基因工程改造的肿瘤神经球中任何内源性荧光蛋白的表达，从而实现跨越整个荧光光谱的染色；iv）可长期保存。

该技术的关键步骤是确保细胞在琼脂糖中充分重悬，以保证细胞均匀分布，避免成团聚集。该技术的一个局限性在于免疫组化染色前所需的细胞培养和神经球（NS）处理步骤较为耗时。第二个局限性是执行该方法所需的细胞数量较多。如果细胞数量少于1 × 106个，则每个切片视野中的神经球簇细胞数量将过少。因此，若胶质瘤细胞生长缓慢，可能难以达到理想的细胞数量。我们使用了一个汇合的T-25培养瓶，其中含有至少3.0 × 106个细胞。所用细胞数量可根据需要调整；但必须获得大小合适的神经球沉淀，以满足包埋操作的要求。此后，包埋...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所资助 & 美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）资助项目 R37-NS094804、R01-NS074387、R21-NS091555（资助 M.G.C.）；NIH/NINDS 资助项目 R01-NS076991、R01-NS082311 和 R01-NS096756（资助 P.R.L.）；NIH/NINDS R01-EB022563；1UO1CA224160；神经外科系；Leah's Happy Hearts 基金（资助 M.G.C. 和 P.R.L.）；RNA 生物医学资助项目 F046166（资助 M.G.C.）。F.M.M. 获 NIH/NINDS F31 资助项目 F31NS103500 支持。J.P. 获富布赖特-阿根廷体育与教育部奖学金支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
涂层切片刀 HP35Thermo Scientific3150734
切片机 RM 2135LeicaMR2135
中性缓冲福尔马林溶液，10%Sigma-aldrichHT501128-4L
兔多克隆抗ATRX抗体Santa Cruz Biotechnologysc-15408IHC，1:250 稀释
兔多克隆抗Ki-67抗体AbcamAb15580IHC，1:1000 稀释
兔多克隆抗OLIG2抗体MilliporeAB9610IHC，1:500 稀释
山羊多克隆抗兔生物素偶联二抗DakoE0432IHC，1:1000 稀释
Vectastain Elite ABC HRP 试剂盒Vector Laboratories IncPK-6100
BETAZOID DAB 显色试剂盒Biocare medicalBDB2004 L/price till 12/18
N-2 添加剂ThermoFisher17502048
N-27 添加剂ThermoFisherA3582801
Accutase® 细胞解离液Biolegend423201
低熔点琼脂糖 LEGoldBioA-201-1000
Genesee Sc. CorporationOlympus 15 ml 离心管21-103
Genesee Sc. CorporationTC-75 处理培养瓶25-209
Genesee Sc. CorporationTC-25 处理培养瓶25-207
DMEM/F12 培养基Gibco11330-057NS 培养基
HBSSGibcoTM14175-103平衡盐溶液
C57BL/6TaconicB6-fC57BL/6 小鼠

参考文献

  1. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
  2. Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
  3. Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
  4. Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
  5. Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
  6. Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
  7. Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
  8. Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
  9. Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
  10. Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
  11. Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
  12. Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
  13. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  14. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).
  15. Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
  16. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425(2006).
  17. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
  18. Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
  19. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
  20. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088(2014).
  21. Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

胶质瘤生物标志物石蜡包埋肿瘤神经球神经球培养ATRX表达Ki67增殖OLIG2分化石蜡切片DAB染色
通过石蜡包埋的三维胶质瘤神经球培养物免疫组织化学评估胶质瘤生物标志物
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。