Presis avsløring av metoder og protokoller er avgjørende for storskala opptak av stamcellebehandlinger. Her presenterer vi en protokoll for å isolere adipose-avledede regenerative celler, som brukes til en enkelt intracavernous injeksjon som behandling av erektil dysfunksjon (ED) etter radikal prostatektomi (RP).
Stamceller brukes på mange forskningsområder innen regenerativ medisin delvis fordi disse behandlingene kan være kurative i stedet for symptomatiske. Stamceller kan fås fra ulike vev og flere metoder for isolasjon er beskrevet. Den presenterte metoden for isolering av fettavledede regenerative celler (ADRCer) kan brukes innenfor mange terapeutiske områder fordi metoden er en generell prosedyre og derfor ikke begrenset til erektil dysfunksjon (ED) terapi. ED er en vanlig og alvorlig bivirkning av radikal prostatektomi (RP) siden ED ofte ikke er godt behandlet med konvensjonell terapi. Å bruke ADRCs som behandling for ED har tiltrukket seg stor interesse på grunn av de første positive resultatene etter en enkelt injeksjon av celler i corpora cavernosum. Metoden som brukes for isolering av ADRCs er en enkel, automatisert prosess, som er reproduserbar og sikrer et ensartet produkt. Videre sikres steriliteten til det isolerte produktet fordi hele prosessen foregår i et lukket system. Det er viktig å minimere risikoen for forurensning og infeksjon siden stamcellene brukes til injeksjon hos mennesker. Hele prosedyren kan gjøres innen 2,5-3,5 timer og krever ikke et klassifisert laboratorium som eliminerer behovet for frakt av vev til et eksternt sted. Prosedyren har imidlertid noen begrensninger siden minimumsmengden av drenert lipoaspirat for at isolasjonsenheten skal fungere er 100 g.
Stamceller har evnen til å skille seg ut i forskjellige celletyper, og de skiller ut parakrinefaktorer som antas å fremme helbredelsesprosessen i skadet vev 1,2,3,4. De er derfor attraktive innen regenerativ medisin, fordi de kan representere en mulig kurativ behandling.
Radikal prostatektomi (RP) er den gylne kurative behandlingen for pasienter med lav/mellomliggende risiko lokalisert prostatakreft og forventet levealder > 10 år. Målet med operasjonen er utryddelse av kreft, men det har flere bivirkninger. Utbredelsen av post-prostatectomy inkontinens varierer fra 2-60% og erektil dysfunksjon (ED) oppleves av 20-90% av pasientene5. Nervesparende teknikk er et alternativ hos noen pasienter (Gleason score < 7, lav risiko for ekstracapsular sykdom)5. Denne teknikken sparer nervene som er ansvarlige for ereksjon, men selv om dette er mulig, rapporterer mange pasienter fortsatt ED postoperativt.
Behandlingsalternativer for penisrehabilitering etter RP består hovedsakelig av behandling med PDE-5-hemmere, injeksjons- eller instillasjonsterapi og vakuumpumper. Medicaments som brukes til penisrehabilitering varierer farmakologisk, men deres virkningsmekanisme inkluderer avslapning av de glatte muskelcellene i corpus cavernosum. Imidlertid opplever mange pasienter behandlingssvikt og oppnår aldri en effekt av medisinen som muliggjør samleie6.
ED som oppstår etter RP antas å skyldes strukturelt irreversible endringer7. Disse endringene forekommer i hulevevet og inkluderer apoptose av glatte muskel- og endotelceller og fibrose. Den veno-okklusive mekanismen som er ansvarlig for en sentral del av ereksjonen, svekkes av endringene, noe som resulterer i dårligere fylling og hardhet i penis7.
Mange av pasientene rapporterer at ED de opplever har en negativ innvirkning på livskvaliteten8. De er ikke klare til å gi opp sin seksuelle aktivitet etter operasjonen, og derfor er en kurativ terapi for ED attraktiv, når de andre tilgjengelige behandlingene for penis rehabilitering mislykkes.
I tidligere studier, inkludert dyre- og små fase 1-studier på mennesker, har stamceller vist lovende resultater som en alternativ behandling for ED 2,9,10,11,12. Resultatene viser at det er trygt å bruke ADRCer, og at erektilfunksjonen er betydelig forbedret etter en enkelt injeksjon i corpora cavernosum 2,9,10,11,12. Adipose-avledede regenerative celler (ADRCs) antas å støtte vev regenerering av parakrine mekanismer gjennom frigjøring av flere hormoner, nevrotrofiske- og andre vekstfaktorer, cytokiner og muligens mikro-RNAs13. I tillegg er ADRCer i stand til å skille seg ut i flere modne celletyper, inkludert endotel- og vaskulære muskelceller, bruskceller, osteocytter og nevroner14,15. Disse egenskapene gjør stamceller interessante for å utvikle en permanent ny behandling for ED.
Stamceller er delt inn i flere grupper, i utgangspunktet de som er avledet fra det tidlige embryoet (embryonale stamceller) og de fra voksent vev (voksne stamceller). Voksne stamceller inkluderer mesenchymale stamceller (MSC) som er multipotente og finnes i benmargen, fettvev, navlestrengsblod, morkake og tannmasse17.
Stamceller fra fettvevet er enkle å få tilgang til, i motsetning til stamceller avledet fra benmarg. Høsting av stamceller fra benmarg er en risikabel og smertefull prosedyre sammenlignet med fettsuging. Antall celler som er mulig å høste fra benmarg vil være begrenset, mens bare pasientens depoter av fettvev setter grensen for antall celler som kan høstes. Det er derfor mulig å isolere en stor mengde stamceller fra fettvevet uten et etterfølgende behov for å dyrke cellene for å oppnå en tilfredsstillende mengde. De adipose-avledede regenerative cellene, også ofte referert til som den stromale vaskulære fraksjonen (SFV), består av mange celletyper, inkludert MSCer, endotelceller, pericytter, immunceller og forfedre herav18. Disse kan alle spille en rolle i den regenerative prosessen.
Målet med den nåværende studien er å undersøke effekten av stamceller på ED etter RP ved å bruke 4 ml autologe ADRCer isolert fra fersk høstet fettvev etter injeksjon i corpora cavernosum.
Den presenterte prosedyren for å isolere ADRCer er ikke begrenset til å brukes bare til ED-terapi, men kan brukes i flere andre former for behandling og eksperimenter. Vår studie viste at autologe, nyisolerte ADRCer er trygge å bruke, og behandlingen er godt utholdelig i en 12 måneders oppfølging.
Før prosedyren brukes, er det noen hensyn som må tas. En ulempe ved denne prosedyren er at pasienten må være under generell anestesi under fettsugingen. Fettsuging er mulig å utføre under lokalbedøvelse, men en tidligere studie har vist at en kombinasjon av lokalbedøvelse og adrenalin kan ha en negativ innvirkning på celleveksten av fibroblaster20. Risikoen for å være under generell anestesi er generelt lav, men et negativt utfall er fortsatt sett. Denne risikoen må tas i betraktning når pasienter velges ut til behandlingen. Fettsuging er en kirurgisk prosedyre og vil derfor alltid bære i fare for komplikasjoner. Som med alle andre kirurgiske prosedyrer, er det fare for postoperativ blødning som resulterer i dannelse av hematomer og risiko for infeksjon. Noen av pasientene våre rapporterte også om en forbigående redusert følsomhet i bukhuden. En umiddelbar komplikasjon til fettsuging er blødning. Det er kjent at pasienter risikerer å få systemiske komplikasjoner når store mengder vev fjernes. Fettsugingen i denne prosedyren var relativt liten og ble derfor ikke ansett som en risikofaktor.
Komplikasjoner til injeksjon av celler rapporteres som forbigående rødhet, ømhet og hematomer.
Enheten som brukes til isolering av ADRCene, ble valgt fordi systemet er CE-godkjent. I Danmark er det obligatorisk å bruke CE-godkjent utstyr fordi myndighetene kategoriserer behandling med stamceller som en legemiddeltestingsstudie, når ADRC brukes til injeksjon hos mennesker.
Enheten har fordeler som at hele prosedyren blir standardisert og utført i et lukket sterilt miljø uten å kreve et høyt klassifisert laboratorium. Risikoen for forurensning er derfor redusert. Dette sikrer at prosedyren er jevn og reproduserbar, og at kvaliteten på sluttproduktet alltid er den samme hver gang (det avhenger imidlertid også av kvaliteten på inngangsvevet). Det er enkelt å utføre isolasjonen på enheten og krever ikke spesialutdannede operatører.
En begrensning ved enheten er at minimumsinngangen til maskinen er 100 g drenert lipoaspirat. Ettersom fettsugingen er helt ferdig før cellebehandlingen starter (og i vårt tilfelle, på et annet sted, ikke i OR) etter vår erfaring, vil dette kreve at mengden lipoaspirat er minst 125 ml ved hjelp av det grove målet på 50 ml sprøyter. Ellers er det fare for at det ikke vil være nok materiale til at maskinen kan fortsette med. Bruk av øvre endegrense (maks inngang er 425 ml) vil også resultere i en veldig lang isolasjonsprosedyre.
Voksne stamceller fra både fettvev og benmarg ser ut til å ha kapasitet til selvfornyelse og differensiering som embryonale stamceller. En av fordelene med ADRCer over hemopoietiske stamceller er et 100-500 ganger høyere utbytte per vevsvolum sammenlignet med benmarg21,22, og derfor trenger adrcs ikke å bli dyrket. Videre er hemopoietiske stamceller vanskeligere og mer smertefulle å høste fra pasienten enn fettvev. I mange situasjoner er fettvev bare et avfallsprodukt etter operasjonen. Det er mulig å dyrke stamceller for å gi et høyere utbytte egnet for angiogenese, men nyisolerte ADRCs kan ha høyere angiogent potensial enn dyrket23.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er grunnlagt av Odense Universitetssykehus (11/31936), Det danske senter for regenerativ medisin (14/50427) og Dansk Kreftforening.
Liposuction | |||
Abdominal Binder | Dale | Size depent of the patient | |
Adhessive OP-towel | Mölnlycke Health Care | 906677 | 90×75 cm |
Adrenalin 1 mg/ml | Amgros I/s | 74 44 23 | 1 ml |
Basic OP supplies | Mölnlycke Health Care | 97010873-07 | |
Carbon Steel blade 11 | Swann-Morton | ||
Chlorhixidine Ethanol | Faarborg Pharma | 5% colored | |
Disposable set Lipocollector 3 | Human Med | 670200 | |
Extension hoses | Extrudan | 5.8/8.3 mm, Ch 25, 3,5 M long | |
Gaze Rags | Barrier | 175201 | 30×45 cm |
Jelonet | Smith and Nephew Medical Ltd | 90509225 | 10 x 10 cm |
Marcaine 5 mg/ml + Adrenaline 5 micrigram | Astra Zeneca | 20 mL | |
Mesorb Bandage | Mölnlycke Health Care | 677001 | 10×13 cm |
Microlance | Becton Dickinson | 304622 | 18 G + 23 G |
Monocryl suture | Ethicon | 04:00 | |
Ringer-lactat | Fresinus Kabi | ||
Sterile gloves | Gammex | 330052065 | |
Surgical Gown | Mölnlycke Health Care | 690103-01 | |
Surgical Marker | Richard-Allan | ||
Surgical Mask | 3M | ||
Syringe | Codan Medical | 6,28,402 | 50/60 ml cath tip |
Syringe | Becton Dickinson | 700016181 | 1 ml |
WAL- Applikator for cannulae 25/30 cm | Human Med | REF 500001 | |
Isolation of ADRC's | |||
1 ml Syringe | Becton Dickinson | REF 303172 | |
3 way stopcock | One Med | REF 10554-01 | |
Adhesive OP-towel | Mölnlycke Health Care AB | REF 906677 | 90×75 cm |
Cytori Celution 800IV device | Cytori | ||
Desinfection swaps | Mediq Danmark | 3340010 | |
Microlance | Becton Dickinson | 25G (0,5*25 mm) | |
Nitril Gloves | Abena | Powder free | |
OR drape Sheet, 2 layers | Lohmann & Rauscher | REF 33005 | |
Ringers Lactate | Fresinus Kabi | 06756 (DK) | |
Sterile gloves | |||
Sterile gown | |||
Supplemental kit for Cytori Celution 800IV devise | Cytori | ||
Termometer | Thomas Scientific | traceable | |
Injection of ADRC's | |||
Aperture drape | One Med | REF1565-01 | 75*90 cm |
Desinfection swap | Mediq Danmark | 3340010 | |
Pean | Leibinger | 32-01257 | |
Silicone Vessel Loop | Purple Surgical | REF PS3203 | |
Sterile gloves | Sempermed | Or Use your favorite |